基因工程7克隆基因的表达概述ppt

7.3 影响基因表达的主要因素
7.3.1 转录
转 录 是 指 遗 传 信 息 从 DNA 分 子 转 移 到 RNA分子的过程，是以DNA分子中的一条链 （有意义链、转录链）为模板，在转录酶的 催化下，进行的一种聚合反应。转录酶即依 赖于DNA的RNA聚合酶。
大 肠 杆 菌 的 RNA 聚 合 酶 由 不 同 亚 基
(2) 中心约在35位置的TTGACA序列，也称 为35序列或识别区。各碱基出现的频率为： T83T83G81A61C69A52 。 35 序 列 提 供 RNA 聚 合 酶识别的信号。
这两个区域对于决定启动子的强度非常重 要，事实上很小的差异对启动子指导转录的效 率有重大影响。一般启动子序列与保守序列相 似程度越高，启动子就越强。
(1) 能识别和除去外源基因中的内含子，加工形 成成熟的mRNA，即带内含子的天然基因是可 以利用的；
(2) 真核细胞将表达的蛋白糖基化，而大肠杆菌 表达的蛋白是无糖基化的，糖基化对某些表达 蛋白的免疫原性影响很大。
真核细胞作宿主表达系统尚存在以下几个问题：
(1) 转化真核细胞的效率低； (2) 表达效率不够高； (3) 细胞培养(动植物) 工艺较复杂，成本高； (4) 选择标记及选择系统较少。
(3) PL ：噬菌体左向启动子，负责 DNA分子 转录的启动子之一。PL是一种可被大肠杆菌 RNA聚合酶识别的强启动子，该启动子被 cI 基因产物所抑制，用 PL构建的表达载体上结 合一个温敏型阻遏物基因（ cI857），在较 低温度（低于30℃）下cI蛋白可抑制PL，在较 高温度（42℃）时cI蛋白失活，导致克隆基因 的转录。
第七章 克隆基因的表达
7.1 基因表达的含义
生物的遗传信息是以基因的形式储存在 DNA分子上的，将DNA分子所承载的遗传信 息转变为由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白 质 分 子 的 过 程 ， 即 为 基 因 的 表 达 (gene expression)。
基因表达的过程为：
利用各种先进的基因导入技术及细胞培养 方法已实现了外源基因在动植物及酵母等真核 宿主细胞中的表达。利用真核细胞作宿主表达 系统的优点是：
总体而言，真核细胞作为表达宿主尚不成 熟，有待于进一步发展、完善。目前普遍采用 原核生物作为表达宿主，原核生物(大肠杆菌) 繁殖速度快，培养简单，因此一些用传统和常 规方法不能或难以大量生产的有生理活性的蛋 白，如果采用“工程菌”来生产就方便得多。
பைடு நூலகம்
7.2 外源基因在大肠杆菌中表达的基本条件
1.基因的编码区域内必须无插入序列（无内含 子），因为原核细胞中缺乏拼接加工系统； 2.基因必须置于大肠杆菌启动子的控制之下， 并能有效地为大肠杆菌RNA聚合酶所识别和 转录； 3.所生成的mRNA必须稳定，且转译效率高； 4.表达产物不会被宿主细胞的蛋白酶迅速降解。
2. 真核细胞启动子中可以找到三个保守区：
(1) 位于12至32 bp之间的TATA框，序列为 TATAATATA，其功能可能为DNA双链开始解 开并决定转录的起点位置。
(2) 位于70至80 bp区域的CAAT框，序列为 GGTCAATCT，其主要作用可能与RNA聚合酶 的结合有关。
(3) 位于更上游约70至100 bp处的GC框，序列 为GGGCGG，也称为增强子（enhancer），其 作用为促进基因的转录，对基因的表达可产生 显著的增强作用。增强子有时位于基因3’端下 游区或在内含子中。
(2’ω)组成，分子量约46万。完整的RNA聚 合酶，即2’ ω ，称为全酶(holoenzyme)； 没 有 亚 基 的 RNA 聚 合 酶 称 为 核 心 酶
(coreenzyme)。亚基(因子)容易同核心酶解离，
其功能是使核心酶能稳定地结合到DNA的启动
子上，故又称为起始因子。
真核生物有三种不同的RNA，因而其RNA 聚合酶也有三种，分别参与不同类型的RNA分 子的合成。
两个高度保守的区域：
(1) 位于转录起始点上游约10个bp的10区域， TATAAT序列(pribnow box)，也称10序列。 10序列的实际位置在不同的启动子中略有变 动，其不同碱基的出现频率为： T89A89T50A65A65T100 。 10 序 列 有 助 于 DNA 局 部双链解开，因为10序列含有较多的A-T对， 所以双链分开所需的能量较低。
真核生物的启动子极为复杂，不同启动子 之间的差异较大。
例如5s rRNA基因，启动子在基因下游，且 在基因内部：
又如爪蟾tRNAMet基因，启动子分成两部分：
真核生物与原核生物的基因结构和转录转 译过程均有明显差异，大肠杆菌的RNA聚合酶 不能识别动物启动子顺序，真核细胞的启动子 在原核细胞中功能很差，所以要得到真核细胞 蛋白的有效表达，应将真核基因放在原核细胞 的强启动子控制之下。
由RNA聚合酶催化的转录过程可分为起始、 延长和终止三个步骤。
7.3.1.1 启动子 标志基因转录起始的位点称启动子。在大
肠杆菌中，启动子被RNA聚合酶的因子所识 别。启动子是一段DNA序列，常位于基因或 操纵子编码顺序的上游，RNA聚合酶结合在上 面。
1. 原核细胞的启动子 原核细胞的启动子在转录起始点的上游有
3. 常用于表达载体的启动子：
(1) PLac：乳糖启动子，是控制LacZ基因转录的 序列。Lac启动子可被IPTG诱导，加入该试剂 到培养基后，将使表达载体中Lac启动子下游 插入的基因开始转录，表达产物为包含-半 乳糖苷酶的融合蛋白。
(2) Ptrp：色氨酸启动子，通常是编码参与色氨 酸生物合成过程中的几种酶的基因簇上游序 列。trp启动子被色氨酸抑制，但易被-吲哚 丙烯酸诱导，也可用色氨酸饥饿诱导，所合 成的蛋白质产量高于PLac表达载体系统。
强启动子是能维持高频率转录的启动子， 通常控制那些细胞需要其大量转译产物的基因 转录；而弱启动子具有相对较低的转录效率， 指导那些仅需要其少量转译产物的基因转录。
利用基因工程技术，可将由弱启动子所控 制的基因放在强启动子的下游，从而获得高效 表达。
两个保守区之间的DNA对启动子的功能也 有影响，各启动子都需要一些最适的间隙，通 常认为间隙为17 bp的启动子功能较强。