RNA的剪接

转录后加工
切除部分序列: – 5′-端 一段前导序列 – 反密码子环 一段插入序列 3′-端CCA-OH的生成 – tRNA核苷酸基转移酶 某些碱基的化学修饰: – 甲基化 – 还原反应 DHU – 脱氨反应
碱基修饰
（1）甲基化
（2） （1） （1）
如：A Am （2）还原反应 如：U DHU （3）核苷内的转位反应 如：U ψ
第六章 RNA转录的剪接与加工
RNA原初转录产物→成熟mRNA 5′端形成帽子结构 3 ′端形成多聚腺苷酸 切去内含子连接外显子（剪接） 反式剪接 部分核苷酸修饰 RNA编辑 RNA再编码 RNA链的断裂
剪接（Splicing）
在5’端帽子和3’端尾巴形成以后，内含子一 个一个被切除，外显子连接形成成熟的mRNA， 这个过程就是RNA的剪接（核内） 。
第一节 原核生物RNA的转录后加工
◆绝大多数mRNA可直接作为翻译的模板，不需加工
◆ rRNA和tRNA的转录产物要加工、修饰
♠ 成熟的rRNA和tRNA5’端是5’-单磷酸； ♠ 比原初转录产物小； ♠ 所有tRNA都含有稀有碱基
一、原核生物rRNA前体的加工
◆ rRNA基因和tRNA基因混合组成一个操纵子：
rRNA processing in eukaryotes-1
加工过程
(1) 切除5′端的前导序列； (2) 从41S的中间产物中先切下18S的片段。
Hela细胞的切点在18S和5.8S之间的ITS（内部转录间隔序
列）； L细胞的切点在 18S序列和ITS的交界处，称为先成熟。 (3) 部分退火，形成发夹结构； (4) 最后修正。
• snRNP（与snRNA结合的核蛋白） a. 概念 : mRNA前体在剪接过程中组装形成的多 组分复合物，主要是由细胞核内小分子RNA和蛋 白质组成 b. 组成: 每种都含有1-2种snRNA和数种蛋白质因 子
U1 snRNP: 8种蛋白质与1种RNA链，与5′剪接点 互补
野生型 U1 RNA 和 12S 前体－mRNA 正常剪接 功能区 D 功能区 C
剪接信号：
在内含子的近3′端有6-12nt保守序列，在哺 乳动物中为YNCURAY（Y：嘧啶，R：代表嘌呤， N表示任何核苷酸）。分支点顺序可和上游序 列互补，形成茎环，但A不配对
5’位点、3’位点和分支位点
剪接体（spliceosome)
参与剪接物质 • snRNA（核内小分子RNA）{U1、U2、U4、U5、U6}
Ⅰ类内含子的自我剪接
Ⅱ类内含子
Ⅱ型内含子在植物和低等真核生物的细 胞器基因组中发现。Ⅱ类内含子的剪接和I 类内含子不同，而和核mRNA 内含子的剪 切有些相似。但也有不同之处。
Ⅱ类内含子的自我剪接
2’ 0H
5’ 外显子 1 GU PyNCUPuAPy AG 外显子 2 3’
5’
外显子 1 OH 3’
U6 snRNP 与内含子5’端剪接区域配对
剪接体的组装与循环
图 13-
hnRNA 的结构模型
hnRNA的加工过程 a. 5’端形成特殊的帽子结构(m7G5’ppp5’ N1mpN2p-) b. 修剪链的3’端，并加上polyA c. 通过剪接除去由内含子转录而来的序列 d. RNA链内的核苷酸被甲基化
Roles of hnRNPs
2、剪接机制与过程
d 3 d 2 d4
16SrRNA-tRNAIlo-tRNA Ala-23SrRNA-5SrRNA
-tRNAsp-tRNATrp ◆加工过程
rrnA-rrnG
特定位点进行甲基化，产生甲基化修饰成分
核酸酶：核酸内切酶：RNaseIII和RNaseE 核酸外切酶：
rRNA processing in prokaryotes
剪切
13nt的保守 顺序 分界顺序 分界顺序 分界顺序 分界顺序 发夹结构 茎和环上的 一对碱基
锤头结构和杂 种RNA 核心顺序和内 部引导序列 分支序列 分支序列
内切 L19 IVS 套索 套索 Y型结构
顺式拼接 顺式拼接 顺式拼接 反式拼接 剪切5'
转酯反应 转酯反应 转酯反应 转酯反应
核酶
半Biblioteka Baidu体 催化
♪ 环磷酸二酯酶（phosphodiesterase）将2′-3′环磷酸打开，
形成3′-OH，2′-P。
♪ 在激酶作用下将5′-OH磷酸化，再通过连接酶将两个半
分子连接起来（须ATP） 。
二、真核生物rRNA 前体的加工
真核生物有4种rRNA。 大亚基（60S）rRNA: 28S(4700nt);5S(120nt);5.8S(160nt)。 小亚基（40S）rRNA ：18S（1900nt)。 其中5.8S rRNA 、18S rRNA 、28 SrRNA 为 一个转录单位，前体为45S RNA。 5S rRNA与tRNA在一个转录单位中。
第二节 真核生物RNA的加工
卵清蛋白基因
DNA mRNA
7.7Kb L 1 2 3 4 5 6 7
transcription spliceosome
exon intron
form lariat RNA, exons close
Remove lariat RNA, join exons
1872bp
核mRNA 锥虫VSG tRNA5'加工
外部引导序列
内切
内切酶， 异体催 连接酶， 化 核酸酶
tRNA内含子
剪切
内含子和反密 码子配对形成 的环
？
内切
半分子
成熟酶
自体催 化
酵母cob内含子
剪切
？
核内不均一RNA 与mRNA的关系 a.有相同的序列 b.在体外能作翻译模板，与mRNA有相同功能 c.两者的5’端都有帽子结构， 3’端有polyA d.两者的转录合成都可以被高剂量放线菌素D抑制
Sm 结合
功能区 B (serum)
3’
A
5’ CAUUCAU 5’外显子 GUGAGG 内含子
12S 腺病毒剪接位点
3’
功能区 A
U2 snRNP:
能与内含子的分支点共同序列互补，另外还与U6 snRNP碱基配对，协助snRNA在剪接体上定向
U4 snRNP:与U6 snRNP偶联形成配对的茎I和 茎II，当剪接体装配时，U4与U6解离开后发挥作 用。U4主要是结合U6直到在剪接需要U6时才释放 它，使之参与5’端剪接 U5 snRNP :与其它snRNA或剪接底物pre-mRNA 的保守区无明显的互补，但它的确同pre-mRNA的 5’和3’端剪接位点有相互作用
的区域对于剪切是重要的，包括受体臂，D环，TψC环和 反密码子环。
加野生型酵母 细胞提取物
凝胶电泳
前体 tRNA 内含子 图 13- 酵母 tRNA 在体外的剪切
环磷酸二酯酶
激酶
连接外显子
♪ 核酸酶作用形成2′-3′环磷酸和5′-OH 而不是3′-OH和5′P，因此不能直接连接（无须ATP） 。
hnRNA的结构特点
5’端有帽子结构(5’-cap) 3’端有polyA+结构 帽子结构的下游3个寡聚U区，长度约30nt 寡聚U区下游有重复序列 茎环结构分布于编码区的两侧 编码区为非重复结构，含有内含子
5’m pppNmNUUUU 寡聚 U 区 ds 单一序列 ds RNA RNA
7
AAAAA……3’ Poly (A)
snoRNA的结构与功能 结构特点
a. Box C框/D框，C框的序列为AUGAUGA, D框 为CUGA,可借助互补序列识别rRNA前体中甲基 化和切割的位点 b. Box H/ACA, H框为ANANNA，能识别假尿苷 酸化位点
功能 与蛋白质结合成snoRNP
参与rRNA前体的加工
box C/D具有互补序列，是指导rRNA中2’-O核糖的甲基化修饰系统， box C参与甲基的 转移反应 box H/ACA能形成茎环二级结构，与rRNA特定 序列互补
d1 d5
d6 A G 心 外显子 1 外显子 2 OH 活 性 中
Ⅱ类内含子的二级结构 (仿 B.Lewin:《GENES》Ⅵ,1997，Fig30.15)
mRNA前体中内含子的结构特点 a. 两端边界有共同序列，这些序列是mRNA前体 的剪接信号
b. 与第一类II型内含子剪接有些类似，必须形成 套索结构（ lariat ）,区别在于真核生物的mRNA的 剪接要求形成剪接体
G U TAPy
外显子 2 AG 3’
套索结构 5’ 外显子 1 外显子 2 3’
图 13- Ⅱ类内含子 剪接的模式
PyPuPyPyTAPy
YAG
CUGAC
不同类型内含子的结构特点和剪切/剪接反应
酶 催化类 型 加工对象 剪切/接 模式 识别信号 特殊结构 反应 中间体
植物类病毒 植物拟病毒 自体催 化 Ⅰ类内含子 Ⅱ类内含子
C 酵 母 切下18S的片段 rRNA 前 体 的 剪 切
切除5′端的前导序列
部分退火
修正
ETS
ITS
rRNA processing in eukaryotes-3
切割位点的确定
核仁小分子RNA （small nucleolar RNA, snoRNA） 参与核糖核酸酶对特定立体结构的识别 rRNA前体分子的甲基化
RNase III
RNase III
二、原核生物tRNA的加工
(1) tRNA基因：约60个 多数：多顺反子
几个相同(不同)tRNA连在一起，成簇存在
与rRNA基因或蛋白基因相连，组成混合
转录单位
少数：单顺反子
(2)加工过程
◆剪切、修剪和剪接（斩头、去尾 ）
核酸内切酶:在tRNA两端切断（cutting） RNA酶P：核糖核蛋白，使tRNA 5’端成熟 RNA酶F：切除多余的3’端序列 RNaseIII和RNaseE：使转录产物变小
(4) tRNA的前体分子中含有内含子。
• 特点： ①位置相同，都在反密码子环的下游；
②不同tRNA的内含子长度和序列各异；
③外显子和内含子交界处无保守序列，不符合Chambon法 则，故其内含子的剪切是依靠RNase异体催化。 ④内含子和反密码子配对形成茎环，改变了反密码子臂的 结构，保护了反密码子，使其免受某些酶的降解。
核酸外切酶：从3’端逐个切去附加的顺序，进行修剪
RNaseD:切除tRNA 3’-CCA-OH下游序列 则露出CCA-OH端， 3’ tRNA 成熟酶
5‘端成熟酶
3‘端成熟酶
ligase Nucleotidyl transferase
◆核苷的修饰（成熟tRNA众多修饰成分）
甲基化：tRNA甲基化酶，甲基供体：SAM 假尿苷：tRNA假尿苷合成酶，催化糖苷键移
位，N1→C5 tRNA核苷转移酶：催化tRNA形成稳定的 3’CCA-OH
修饰：氨基 酸臂上5′的 4-硫尿苷 （4tu）
D臂上的2 甲基鸟苷 （2mG） TψC臂上的 假尿苷（ψ） 反密码子环 上的2异戊 腺苷（2ipA）
图13-3 tRNA 前体特殊碱基
三、原核生物mRNA前体的加工
少数多顺反子mRNA须通过核酸内切酶 切成较小的单位，然后再进行翻译，加工 的意义在于可对mRNA的翻译进行调控。
（3） （4）
（4）脱氨反应 如：A I
真核tRNA内含子的切除和其他内含子的切除的不 同
①即没有交界序列，也没有内部引导序列；
②是依赖于蛋白质性的RNase，而不是核糖拟酶 或snRNP； ③反应的本质不是转酯反应。
真核tRNA内含子的精确剪切是依赖对tRNA共同的二
级结构的识别，而不是内含子的保守序列。分子不同部分
L123 4 5 6 7
Mature mRNA
一、真核生物tRNA 前体的加工
RNA pol III
Intron Exon
tRNA的转录前体
A 真核tRNA的基因和原核不同：
(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间
有间隔区； (2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多，如酵母 约有400个tRNA基因； (3) 5′端单磷酸核苷酸，表明已被加工过；
转录后的加工和与核糖体的装配同时进行
三、真核生物mRNA的剪接
1、mRNA 前体剪接概述
内含子及其剪接方式的分类
① 第一类：自我剪接内含子,又可分为Ⅰ型和 Ⅱ型内含子 ② 第二类：需蛋白质（酶）参与剪接的内含 子 ③ 第三类：依赖sn RNP剪接的内含子
Ⅰ型内含子
Ⅰ型自我剪接内含子在线粒体基因组中发现，也 存在于极少数单细胞真核生物(如嗜热四5′5′膜 虫的rRNA)的核基因组中。原核体系中少数内含子 也是Ⅰ型内含子（如T4噬菌体胸苷酸合成酶基因） 。