第八章mRNA剪接编辑
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mRNA剪接编辑
真核生物基因组DNA的结构
真核基因大多是断裂的: 一个基因可由多个内含子和外显子间隔排 列而成。 内含子在真核基因中所占的比例很高，甚 至超过99%。
RNA
部分人类基因中内含子序列所占的比重分析
前体mRNA--hnRNA
5’-Cap
3‘-Poly(A)
mRNA 剪接
成熟mRNA的转运
CPSF
PAP
PAPB
Pol II的CTD促进切割
3 端多聚腺苷酸尾巴的功能
提高mRNA的稳定性 在核－质转运中起作用 提高mRNA的翻译效率 影响最后一个内含子的切除
创造终止密码子UGA
选择性加尾调节基因的表达
3. RNA剪接(Splicing)
真核生物mRNA前体的剪接
剪接体中的snRNP 的功能
snRNP snRNA(nt) 在拼接中可能的作用
U1
U2 U5/ U4/ U6
165
185 116/ 145/106
通过序列互补，结合到5拼接位点上
结合到分枝位点(U2AF)，催化转酯反 应,与U6配对 三聚体 U5: 结合5与3拼接点外显子 U4：拼接体的组装 U6：结合5拼接点，与U2一起催化转 酯反应
mRNA前体的加工内容： 3. 内含子的剪接
1. mRNA依赖snRNA的拼接
2.选择拼接
3.顺式和反式拼接 4. I型自我拼接 5. II型自我拼接
1. 5 端添加帽子结构 2. 3 端添加多聚腺苷酸
真核生物成熟mRNA形成的过程
断裂基因发现不久，Crick（1978年）提出了一系 列发人深思的问题：
RNA加工过程及其生理功能
断裂基因 hnRNA，hnRNP，sRNA Exons (外显子): the coding sequences Introns (内含子) : the intervening sequences RNA splicing: 去除pre-mRNA的内含子形成成熟 mRNA的过程.
两个剪接位点的序列是不同的，左边的剪 接位点称供体（donor）位点，右边的剪接 位点称受体（acceptor）位点。
GU-AG法则（GU-AG rule）不适用于线粒 体、叶绿体的内含子，也不适用于酵母的 tRNA基因
mRNA结构特点
边界序列:其边界序列是完全符合GU-AG法则 分枝点序列：具有分枝点序列，位于内含子3’端 上游18-50nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95， 其中A为百分之百的保守，且具有2’-OH。 内含子5′端有一保守序列(5’-GUAAGUA-3’)可以 和U1 snRNA的5’端的保守序列3’-CAUUUCAU-5’ 互补。
mRNA的多聚腺苷酸化过程
CPSF因子专一性与加尾信号AAUAAA结合 CstF因子与富GU区结合 CFI、CFII在加尾信号下游的15～25 nt处切割 poly(A)多聚酶催化多聚腺苷酸化，先添加约10 个腺苷酸，速度较慢 poly(A)结合蛋白的结合加快多聚酶延伸速度， 控制多聚腺嘌呤尾巴的长度
mRNA的剪接
转录产生的核内RNA前体分子与蛋白质结合，形 成RNA和蛋白质组成的snRNP复合物（ribonucleoprotein particle）。 随着RNA链的延伸，每个内含子5’和3’两端的复 合物成对联结，产生60S的颗粒—剪接体 （spliceosome），进行RNA前体分子的剪接。
100种内含子的5′端都是GU；3′端都是AG，因此称为 GU-AG法则（GU-AG rule），又称为Chambon法则。
5’splice site (5’剪接位点): the exon-intron boundary at the 5’ end of the intron 3’ splice site (3’剪接位点): the exonintron boundary at the 3’ end of the intron Branch point site (分枝位点): an A close to the 3’ end of the intron, which is followed by a polypyrimidine tract (Py tract).
hnRNA
hnRNA (heterogeneous nuclear RNA):核内不 均一RNA，是mRNA的原初转录产物在核 内形成的大小不等的中间物，相对分子质 量大，也不均一，成为hnRNA。 hnRNA与mRNA的关系：
两者具有部分相同的序列； 两者都可以做翻译的模板； 两者都有5-端帽子和3-端polyA尾巴； 两者都是由RNA聚合酶转录
5’-splicing site
3’-splicing site
Lariart
Debranch& degraded
Biochemical steps of pre-mRNA splicing
Step 1 of Splicing
•a cut is made at the 5’splice site, separating the left exon and the right intron-exon. •The right intron-exon molecule forms a lariat(套马索), in which the 5’-terminus of the intron becomes linked by a 5’-2’bond to a base within the intron. • The target base is an A in a sequence that is called the branch site.
有效的信号是： AAUAAA及随后的 23-24nt的富GU区， 再后的富U区。 参与的蛋白因子： CPSF，CstF，CFI， CFII
加尾反应需要的顺式元件
3 端添加多聚腺苷酸
长度：20～200 nt 加尾信号： 切割与加尾： a. 剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF） b. 剪切刺激因子（cleavage stimulation factor, CstF） c. 剪切因子I，II（CFI， CFII） d. poly(A)多聚酶（polyadenylate polymerase, PAP） e. poly(A)结合蛋白（poly (A) binding protein, PBP）
Step1
RNA三磷酸酶
鸟苷转移酶
GMP
Step2
SAM
Step3
CAP1:OCH3
CAP2:OCH3
CAP 0Biblioteka Baidu
帽子的类型
在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O类帽子 （capO）；
在次末端核苷酸的核糖上的2′-O位点上还有一个甲基位
点的称1类帽子(cap 1)；
此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-O）有甲基化位点 的称2类帽子（cap2）。
加帽的顺序
当新生RNA链长度约为25nt 时，其5’端经修饰被加上 一个7-甲基G，以5’-5’三磷酸连接。 RNA三磷酸酶(Triphosphatase) 鸟苷酸转移酶（guanyltransferase） 鸟嘌呤-7-甲基转移酶（guanosine ethyltransferase） 反应步骤如下： 核苷酸水解酶从RNA的5‘-端切掉γ 基团； 鸟苷酸转移酶将来自GTP的GMP连接到RNA 5’-端的β 磷酸上，形成5-5三磷酸，释放出PPI 甲基转移酶催化SAM的甲基转移到Cap-0的N7位。
这 三 种 帽 子 都 有 特 殊 面 对 面 核 苷 酸 结 构 （ confronted nucleotide structure）。
HN—CH3
m7G
帽子0
mRNA 5端的帽子位臵 和可被甲基化的位点
三种5’帽结构形式
帽0 普遍存在
m7GpppXpYp------
帽1
m7GpppXmpYp-----
细胞核中的小分子RNA称为细胞核小RNA（small nuclear RNA,snRNA); 位于细胞质中的称为细胞质小RNA(small cytoplasmicRNA,scRNA)。 在自然状态下，它们以核糖核蛋白颗粒（SnRNP 和scRNP）的形式存在，俗称snurps和scyrps。 在核仁中也存在着一类小的RNA，称为核仁小 RNA(small nucleolarRNA, snoRNA),它们在rRNA 的加工中起作用。 snRNA参与剪接过程，并于其它蛋白一起构成一 个大的颗粒复合体,称为剪接体(splicesome)。
拼接体组装 第一次转酯：左外元、内元剪切套索 第二次转酯：exons连接、套索状内元释放 拼接体(spliceosome)解体与套索(lariat)降解 同步
The simplified mechanism of nuclear mRNA precursor
2‘-hydroxyl group of A residue of branchpoint
Spliceosome(剪接体)
剪接过程由 U1, U2, U4, U5 , U6 snRNPs催化，也有 其他剪接因子的参与。 这些snRNPs中的RNA成分与 5’-和 3’剪接点及分支 点的多种保守碱基配对。 Splicesome: The large RNA-protein body on which splicing of nuclear mRNA precursors occurs.
（1）剪切作用若是通过酶来进行的，那么这种剪接 酶是怎样识别RNA上特定的位点？ （2）剪切酶有没有特异性？对不同的RNA是否需要 不同的酶？ （3）切除的RNA是以线状还是环状存在的？切下的 RNA的命运将如何？
GU-AG法则
Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割 位点，发现有2个特点： （1）内含子的两个末端并不存在同源或互补； （2）连接点具有很短的保守序列,亦称边界序列。
hnRNP
hnRNP:核糖核蛋白颗粒
hnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒 (hnRNP)，颗粒中蛋白质包围着hnRNA， 这种hnRNA和蛋白质组成的复合物称为 hnRNP。
1. mRNA 加帽
帽子结构 (m7GpppGp-) 7-甲基鸟核苷三磷酸:它由甲基化 鸟苷酸经焦磷酸化与mRNA的5‘末端核苷酸相连，形成 5’,5‘-三磷酸连接(5’,5‘-triphosphate linkage)， mRNA5’端 的这种结构称为帽子(cap)。 反应空间：在mRNA的5‘-端加上m7GTP的结构。此过程 发生在细胞核内，即hnRNA即可进行加帽。 加工过程:首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水 解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G 进行甲基化。
U2和U6构成催化反应的核心,U5拉近相邻的2个外显子
U2 snRNP可以与分支点序列配对
U6 snRNP可以与5‘端剪接区域配对
真核生物mRNA前体中内含子剪接过程示意图
由U1 snRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5’剪接点， 由结合在3’剪接点上游富嘧啶区的U2AF（U2 auxiliary factor） 识别3’剪接点并引导U2 snRNP与分支点相结合，形成剪接 前体（pre-spliceosome）。 剪接前体进一步与U4、U5、U6 snRNP三聚体相结合，形成 剪接体。
普遍存在
帽2
m7GpppXmpYmp-----
很少发生
帽子结构的功能
1.
2. 3. 4.
5.
有助于mRNA跨越核膜转运; 保护 mRNA 5′不被酶降解； 使mRNA能与核糖体小亚基结合； 被蛋白质合成的起始因子所识别，促进蛋白质 合成; 提高剪接效率
2. Poly A 尾巴
多聚腺苷化的信号及参与的蛋白因子
Spliceosome 剪接体 Self-splicing introns and mechanisms
Alternative splicing (可变剪接): 有些pre-mRNAs 可以通过不同的剪接方式产生不同的成熟的 mRNA. 60% of the human genes are spliced in this manner.
真核生物基因组DNA的结构
真核基因大多是断裂的: 一个基因可由多个内含子和外显子间隔排 列而成。 内含子在真核基因中所占的比例很高，甚 至超过99%。
RNA
部分人类基因中内含子序列所占的比重分析
前体mRNA--hnRNA
5’-Cap
3‘-Poly(A)
mRNA 剪接
成熟mRNA的转运
CPSF
PAP
PAPB
Pol II的CTD促进切割
3 端多聚腺苷酸尾巴的功能
提高mRNA的稳定性 在核－质转运中起作用 提高mRNA的翻译效率 影响最后一个内含子的切除
创造终止密码子UGA
选择性加尾调节基因的表达
3. RNA剪接(Splicing)
真核生物mRNA前体的剪接
剪接体中的snRNP 的功能
snRNP snRNA(nt) 在拼接中可能的作用
U1
U2 U5/ U4/ U6
165
185 116/ 145/106
通过序列互补，结合到5拼接位点上
结合到分枝位点(U2AF)，催化转酯反 应,与U6配对 三聚体 U5: 结合5与3拼接点外显子 U4：拼接体的组装 U6：结合5拼接点，与U2一起催化转 酯反应
mRNA前体的加工内容： 3. 内含子的剪接
1. mRNA依赖snRNA的拼接
2.选择拼接
3.顺式和反式拼接 4. I型自我拼接 5. II型自我拼接
1. 5 端添加帽子结构 2. 3 端添加多聚腺苷酸
真核生物成熟mRNA形成的过程
断裂基因发现不久，Crick（1978年）提出了一系 列发人深思的问题：
RNA加工过程及其生理功能
断裂基因 hnRNA，hnRNP，sRNA Exons (外显子): the coding sequences Introns (内含子) : the intervening sequences RNA splicing: 去除pre-mRNA的内含子形成成熟 mRNA的过程.
两个剪接位点的序列是不同的，左边的剪 接位点称供体（donor）位点，右边的剪接 位点称受体（acceptor）位点。
GU-AG法则（GU-AG rule）不适用于线粒 体、叶绿体的内含子，也不适用于酵母的 tRNA基因
mRNA结构特点
边界序列:其边界序列是完全符合GU-AG法则 分枝点序列：具有分枝点序列，位于内含子3’端 上游18-50nt处，序列为Py80NPy87Pu75APy95， 其中A为百分之百的保守，且具有2’-OH。 内含子5′端有一保守序列(5’-GUAAGUA-3’)可以 和U1 snRNA的5’端的保守序列3’-CAUUUCAU-5’ 互补。
mRNA的多聚腺苷酸化过程
CPSF因子专一性与加尾信号AAUAAA结合 CstF因子与富GU区结合 CFI、CFII在加尾信号下游的15～25 nt处切割 poly(A)多聚酶催化多聚腺苷酸化，先添加约10 个腺苷酸，速度较慢 poly(A)结合蛋白的结合加快多聚酶延伸速度， 控制多聚腺嘌呤尾巴的长度
mRNA的剪接
转录产生的核内RNA前体分子与蛋白质结合，形 成RNA和蛋白质组成的snRNP复合物（ribonucleoprotein particle）。 随着RNA链的延伸，每个内含子5’和3’两端的复 合物成对联结，产生60S的颗粒—剪接体 （spliceosome），进行RNA前体分子的剪接。
100种内含子的5′端都是GU；3′端都是AG，因此称为 GU-AG法则（GU-AG rule），又称为Chambon法则。
5’splice site (5’剪接位点): the exon-intron boundary at the 5’ end of the intron 3’ splice site (3’剪接位点): the exonintron boundary at the 3’ end of the intron Branch point site (分枝位点): an A close to the 3’ end of the intron, which is followed by a polypyrimidine tract (Py tract).
hnRNA
hnRNA (heterogeneous nuclear RNA):核内不 均一RNA，是mRNA的原初转录产物在核 内形成的大小不等的中间物，相对分子质 量大，也不均一，成为hnRNA。 hnRNA与mRNA的关系：
两者具有部分相同的序列； 两者都可以做翻译的模板； 两者都有5-端帽子和3-端polyA尾巴； 两者都是由RNA聚合酶转录
5’-splicing site
3’-splicing site
Lariart
Debranch& degraded
Biochemical steps of pre-mRNA splicing
Step 1 of Splicing
•a cut is made at the 5’splice site, separating the left exon and the right intron-exon. •The right intron-exon molecule forms a lariat(套马索), in which the 5’-terminus of the intron becomes linked by a 5’-2’bond to a base within the intron. • The target base is an A in a sequence that is called the branch site.
有效的信号是： AAUAAA及随后的 23-24nt的富GU区， 再后的富U区。 参与的蛋白因子： CPSF，CstF，CFI， CFII
加尾反应需要的顺式元件
3 端添加多聚腺苷酸
长度：20～200 nt 加尾信号： 切割与加尾： a. 剪切/多聚腺苷酸化特异性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor, CPSF） b. 剪切刺激因子（cleavage stimulation factor, CstF） c. 剪切因子I，II（CFI， CFII） d. poly(A)多聚酶（polyadenylate polymerase, PAP） e. poly(A)结合蛋白（poly (A) binding protein, PBP）
Step1
RNA三磷酸酶
鸟苷转移酶
GMP
Step2
SAM
Step3
CAP1:OCH3
CAP2:OCH3
CAP 0Biblioteka Baidu
帽子的类型
在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O类帽子 （capO）；
在次末端核苷酸的核糖上的2′-O位点上还有一个甲基位
点的称1类帽子(cap 1)；
此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-O）有甲基化位点 的称2类帽子（cap2）。
加帽的顺序
当新生RNA链长度约为25nt 时，其5’端经修饰被加上 一个7-甲基G，以5’-5’三磷酸连接。 RNA三磷酸酶(Triphosphatase) 鸟苷酸转移酶（guanyltransferase） 鸟嘌呤-7-甲基转移酶（guanosine ethyltransferase） 反应步骤如下： 核苷酸水解酶从RNA的5‘-端切掉γ 基团； 鸟苷酸转移酶将来自GTP的GMP连接到RNA 5’-端的β 磷酸上，形成5-5三磷酸，释放出PPI 甲基转移酶催化SAM的甲基转移到Cap-0的N7位。
这 三 种 帽 子 都 有 特 殊 面 对 面 核 苷 酸 结 构 （ confronted nucleotide structure）。
HN—CH3
m7G
帽子0
mRNA 5端的帽子位臵 和可被甲基化的位点
三种5’帽结构形式
帽0 普遍存在
m7GpppXpYp------
帽1
m7GpppXmpYp-----
细胞核中的小分子RNA称为细胞核小RNA（small nuclear RNA,snRNA); 位于细胞质中的称为细胞质小RNA(small cytoplasmicRNA,scRNA)。 在自然状态下，它们以核糖核蛋白颗粒（SnRNP 和scRNP）的形式存在，俗称snurps和scyrps。 在核仁中也存在着一类小的RNA，称为核仁小 RNA(small nucleolarRNA, snoRNA),它们在rRNA 的加工中起作用。 snRNA参与剪接过程，并于其它蛋白一起构成一 个大的颗粒复合体,称为剪接体(splicesome)。
拼接体组装 第一次转酯：左外元、内元剪切套索 第二次转酯：exons连接、套索状内元释放 拼接体(spliceosome)解体与套索(lariat)降解 同步
The simplified mechanism of nuclear mRNA precursor
2‘-hydroxyl group of A residue of branchpoint
Spliceosome(剪接体)
剪接过程由 U1, U2, U4, U5 , U6 snRNPs催化，也有 其他剪接因子的参与。 这些snRNPs中的RNA成分与 5’-和 3’剪接点及分支 点的多种保守碱基配对。 Splicesome: The large RNA-protein body on which splicing of nuclear mRNA precursors occurs.
（1）剪切作用若是通过酶来进行的，那么这种剪接 酶是怎样识别RNA上特定的位点？ （2）剪切酶有没有特异性？对不同的RNA是否需要 不同的酶？ （3）切除的RNA是以线状还是环状存在的？切下的 RNA的命运将如何？
GU-AG法则
Chambon等分析比较了大量结构基因的内含子切割 位点，发现有2个特点： （1）内含子的两个末端并不存在同源或互补； （2）连接点具有很短的保守序列,亦称边界序列。
hnRNP
hnRNP:核糖核蛋白颗粒
hnRNA的物理结构是核糖核蛋白颗粒 (hnRNP)，颗粒中蛋白质包围着hnRNA， 这种hnRNA和蛋白质组成的复合物称为 hnRNP。
1. mRNA 加帽
帽子结构 (m7GpppGp-) 7-甲基鸟核苷三磷酸:它由甲基化 鸟苷酸经焦磷酸化与mRNA的5‘末端核苷酸相连，形成 5’,5‘-三磷酸连接(5’,5‘-triphosphate linkage)， mRNA5’端 的这种结构称为帽子(cap)。 反应空间：在mRNA的5‘-端加上m7GTP的结构。此过程 发生在细胞核内，即hnRNA即可进行加帽。 加工过程:首先是在磷酸酶的作用下，将5'-端的磷酸基水 解，然后再加上鸟苷三磷酸，形成GpppN的结构，再对G 进行甲基化。
U2和U6构成催化反应的核心,U5拉近相邻的2个外显子
U2 snRNP可以与分支点序列配对
U6 snRNP可以与5‘端剪接区域配对
真核生物mRNA前体中内含子剪接过程示意图
由U1 snRNA以碱基互补的方式识别mRNA前体5’剪接点， 由结合在3’剪接点上游富嘧啶区的U2AF（U2 auxiliary factor） 识别3’剪接点并引导U2 snRNP与分支点相结合，形成剪接 前体（pre-spliceosome）。 剪接前体进一步与U4、U5、U6 snRNP三聚体相结合，形成 剪接体。
普遍存在
帽2
m7GpppXmpYmp-----
很少发生
帽子结构的功能
1.
2. 3. 4.
5.
有助于mRNA跨越核膜转运; 保护 mRNA 5′不被酶降解； 使mRNA能与核糖体小亚基结合； 被蛋白质合成的起始因子所识别，促进蛋白质 合成; 提高剪接效率
2. Poly A 尾巴
多聚腺苷化的信号及参与的蛋白因子
Spliceosome 剪接体 Self-splicing introns and mechanisms
Alternative splicing (可变剪接): 有些pre-mRNAs 可以通过不同的剪接方式产生不同的成熟的 mRNA. 60% of the human genes are spliced in this manner.