微生物实验技术

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实验3-1 微生物的形态观察
三、实验材料
1. 菌种与染料 根据不同的菌种采用不同的染液，
见表3-1和附录Ⅳ。
2. 仪器和其他用品 显微镜，接种环，解剖刀，
镊子，酒精灯，载玻片，盖玻片，石蜡油，吸水纸，擦
镜纸。
表3-1 不同微生物种类所使用的染液
Fra Baidu bibliotek
微生物类群
细菌
放线菌
4.染色 将涂片置于玻片搁架上，加适量(以盖满菌膜 为度)番红染液或吕氏美兰染液于菌膜部位，染色1～2分钟。
5.水洗 倾去染色液，用洗瓶中的自来水自载玻片一端 轻轻冲洗，至流下的水中无染色液的颜色时为止。
6.干燥和镜检 让其自然干燥或用吸水纸吸去载玻片上 多余的水分后。先用低倍镜找到物像后再用油镜观察。
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实验3-1 微生物的形态观察
（二）放线菌、霉菌的染色
1.制片及染色 用解剖刀从菌落的边缘连同培养基一
起挑取少量带有孢子的菌丝，置于载玻片中央，先用另一
载玻片使劲挤压有菌部分，使得菌群铺成一薄层，然后将
载玻片中央置于酒精灯火焰上方加热，使培养基融化，冷
却后，在载玻片的中央有菌部分滴加2滴石炭酸复红或乳酸
石炭酸棉蓝染液，再轻轻盖上盖玻片，注意避免产生气泡。
2. 镜检 先用低倍镜观察，再换高倍镜观察。
五、实验报告 绘出所观察到的各种微生物的形态。
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实验3-2 细菌特殊结构的观察
一、实验目的 1.掌握芽孢染色的方法； 2.学习并初步掌握鞭毛染色法，观察细菌鞭毛的形态特 征； 3.学习并掌握荚膜染色的基本方法。 二、实验原理 细菌的芽孢具有厚而致密的壁，透性低，着色、脱色都 比营养细胞困难。芽孢染色法就是根据这一特点设计的：采 用一着色力强的染料，并用微火加热，使菌体和芽孢同时着 色后再用水洗，使菌体脱色而芽孢仍保留已着的颜色。
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实验3-2 细菌特殊结构的观察
（二）鞭毛染色 1.菌种的准备 冰箱保存的菌种要连续移种1～2次，取 新配制的营养琼脂斜面接种，28～32℃培养10～14h。 2.载玻片的准备 玻片要求光滑，洁净，忌带油迹。将 载玻片在含适量洗衣粉的水中煮沸约20min，取出用清水充 分洗净，沥干水后置于95%乙醇中，用时取出在火焰上烧去 酒精及可能残留的油迹。 3.菌液的制备 取斜面或平板菌种培养物数环于盛有 1～2 mL无菌水的试管中，制成轻度混浊的菌悬液用于制片。
观察目 的
芽孢
鞭毛
荚膜
实验菌 枯草芽孢杆 苏云金芽孢杆 褐球固氮
种
菌
菌
菌
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实验3-2 细菌特殊结构的观察
四、实验方法 （一）芽孢的染色 1.涂片 取培养24h左右的枯草杆菌，涂片、干燥、固 定。 2.初染 加3～5滴孔雀绿染色液于已固定的涂片上， 用木夹夹住载玻片，用微火加热至染液冒蒸汽时开始计算时 间，约维持5min。加热中应随时注意补加染液，切勿使标本 干涸。 3.水洗 待玻片冷却后倾去染液，水洗至不再褪色为 止。 4.复染 加番红液1滴，染色1min，水洗。 5.镜检 干燥后用油镜观察。
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实验3-1 微生物的形态观察
图3-1 无菌操作及做涂片的过程
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实验3-1 微生物的形态观察
2.干燥 将涂片自然风干或将载玻片置于酒精灯火焰高 处微热烘干，但不能直接在火焰上烘烤，以免菌体变形。
3.固定 手执涂片一端，有菌膜的一面向上，迅速通过 火焰2～3次，使菌体固定于载玻片上，待载玻片冷却后，再 加染料。
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实验3-2 细菌特殊结构的观察
三、实验材料 1.菌种 根据观察目的的不同，选用不同的实验菌 种，见表3-2。 2.染料及试剂 孔雀绿染色液，硝酸银鞭毛染色液， 黑色素水溶液（见附录Ⅳ），番红溶液，甲醇。 3.仪器和用品 显微镜，木夹子，载玻片，酒精灯 等。
表3-2 细菌特殊结构观察所选用的菌种
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实验3-1 微生物的形态观察
在微生物形态观察中，根据不同的种类，需采用不 同的染液和染色方法。
染色前必须固定微生物，其目的有二：一是杀死微 生物并使菌体粘附于载玻片上；二是增加其对染料的亲 和力。常用的有加热和化学固定两种方法，固定时应尽 量维持细胞的原有形态，防止细胞膨胀或收缩。
酵母菌
霉菌
菌种
大肠杆菌 细黄链霉菌 米酒酵母
根霉
染液
番红
石炭酸复红 吕氏美兰 乳酸石炭酸 棉蓝
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实验3-1 微生物的形态观察
四、实验方法 （一）细菌、酵母菌的染色 染色操作程序为： 涂片——干燥——固定——染色——水洗——干燥— —油镜观察。 1. 涂片 取干净载玻片，于中央加蒸馏水一小滴，将 接种环在火焰上灼烧灭菌，冷却后，取试管斜面一支，按 无菌操作法用接种环从菌种斜面表面挑取细菌少许(注意不 要挑破培养基)，涂在载玻片水滴中，涂面约为1cm2的均匀 薄膜。如果是液体培养物则不必加水，直接取菌液1～2环 涂片，接种环经灭菌后放回原处。无菌操作及做涂片的过 程见图3-1。
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实验3-2 细菌特殊结构的观察
细菌的鞭毛极细，其直径通常为10～20nm，只能用电子 显微镜观察。要用普通光学显微镜观察细菌的鞭毛，必须用 鞭毛染色法。其基本原理是在染色前先用媒染剂处理，使媒 染剂沉积在鞭毛上，鞭毛直径加粗，然后再进行染色。
荚膜是包围在细菌细胞外面的一层粘液性物质，其主要 成分是多糖、糖蛋白或多肽，荚膜与染料之间的亲和力弱， 不易着色，且可溶于水，易在水洗时被除去。但荚膜的通透 性较好，一些染料可透过荚膜而使菌体着色，故常采用负染 色法，使菌体和背景着色，荚膜不着色；因而荚膜在菌体周 围呈一透明圈。荚膜很薄，含水量又高(90%以上)，故染色 时不用热固定，以免荚膜皱缩变形。
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微生物的鉴定
实验3-1 微生物的形态观察 实验3-2 细菌特殊结构的观察 实验3-3 革兰氏染色法 实验3-4 微生物大小测定与计数 实验3-5 微生物的理化性能鉴定
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实验3-1 微生物的形态观察
一、实验目的 1. 学习微生物涂片、染色的基本技术。 2. 掌握微生物的简单染色法。 3. 熟悉细菌、放线菌、酵母菌、霉菌在形态上的主要区 别。 二、实验原理 微生物的细胞小而透明，在普通光学显微镜下不易识别， 必须借助于染色，使菌体着色以增加菌体的显示力，从而更 清楚地观察到其形态和结构。