纤维素酶的分离纯化
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制药1102
罗志强
孟豪轩
陈孟南的来源
2
3 4 5
纤维素酶的分离提纯技术 纤维素酶的应用 纤维素酶的问题与展望
概念
纤维素是地球上最丰富的可再生性碳源物质 ，其降解是自然界碳素循环的中心环节，有效利 用纤维素可有效解决能源危机，可以用于生产大 量化工原料，如乙醇，丁醇等，采用纤维素酶进 行水解是保证无污染地将这些纤维素物质转化成 简单糖的关键。 纤维素酶的组分复杂，主要有内切葡聚糖酶，外 切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶3种。给纤维素酶的分 离纯化带来了一定的困难。
3.纤维素酶的应用领域应进一步拓宽。
（一）分子量：45000-76000； 最适pH：pH4-5；最适温度： 40-60℃ 。 （二）纤维素酶各组分大多为糖 纤维素酶的分子结构 蛋白。 （三）纤维素酶是诱导酶，诱导 物为纤维二糖。
纤维素酶
昆虫
真菌
软体动物
纤维素酶
原生动物
放线菌 细菌 目前研究较多的是霉菌，其中酶活力较强的菌 种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里斯木霉、 绿色木霉、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较 好的纤维素酶生产菌。
通常采用的中性盐有
硫酸铵、硫酸钠、硫酸
钾、硫酸镁、氯化钠和磷
酸钠等。
纤维素酶的分离纯化多采用硫酸铵分级沉淀法，因 为硫酸铵具有溶解度大，对温度变化不敏感，分级 效果好等特点。
陈红漫等在芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特 性的研究中采用硫酸铵分级沉淀法对粗酶液分离纯 化，结果显示在硫酸铵饱和度区间为20%~60% 时，经硫酸铵沉淀后，酶纯化倍数为 1.42，回收 率为 11.41%。
纤维素酶在造纸、草药提取等方面均有很 大应用潜力。用纤维素酶适当处理纸浆，能增加 微细纤维生成量和提高保水度，有可能促进某些 纸张抗张力提高。
1.纤维素酶作用机理有待进一步研究，由于纤维 素酶的空间结构复杂，加之纤维素酶不易分离纯 化、结晶难，应进一步在分离纯化技术和研究方 法上进行突破。
2.目前纤维素酶的产量和活性都不高，成本偏高， 今后应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作， 分离和筛选出针对不同行业的高效纤维素分解菌 群。
纤维素酶的分离纯化
纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生 产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸铵沉淀法，酒精 沉淀法，丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。但 在纤维素酶的分析研究上个常采用一些列的蛋白 质分离纯化技术，如分级沉淀法，凝胶过滤法等。
沉淀法（盐析）
☻盐析沉淀法的原理：
高盐浓度下盐离子与酶蛋白质分子争夺水分 子，除去蛋白质的水合外壳， 降低溶解度而沉淀。
等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳是依据蛋白质分子的等电点不同#在 一个连续的，稳定的线性pH梯度中电泳的蛋白质 分离和分析技术，等电聚焦电泳具有很高的分辨 率，可以分离等电点相差 0.01~0.02个pH单位 的蛋白质。
双水相体系萃取法
双水相体系萃取是利用两种聚合物或多聚物在水 相中的不相溶性，形成两相，两相对蛋白质分子 的亲和能力不同，达到从样品溶液中直接分离纯 化蛋白质的目的，也可起到浓缩蛋白质的作用。 双水相体系萃取具有条件温和"产品活性损失少， 处理量大，设备投资小，操作简单，易于放大及 连续操作等优点，广泛应用于蛋白质，酶，核酸 及多糖等生物大分子的分离纯化。 舒国伟等运用双水相萃取技术对纤维素酶进行萃 取，结果表明，在聚乙二醇4000——硫酸铵双水 相体系中，双水相体系的质量组成为硫酸铵8%， EG4000为26%,pH为4.8时,分配系数 K为 5.21，萃 取率为 79.4%
纤维素酶用作饲料添加剂,能明显提高饲料消化率 和利用率,促进动物生长。在奶牛的养殖上,纤维素 酶能增强奶牛食欲,增加其对粗饲料的采食量,提高 饲料的消化率和利用率,提高产奶量,同时,还能降 低奶牛消化道的发病率。
天然纤维如棉、麻等纺织品具有较强的吸湿、 透气性，备受消毒者青睐。但棉、麻及其混纺布料 上存在细毛，与皮肤接触时会产生刺痒感，因此近 几年来，利用纤维素酶进行生物整理越来越受到纺 织界的重视。利用纤维素酶进行酶处理，能使麻、 棉表面剥离和纵向复合细胞间层侵蚀，使纤维梢丝 束化或脱落，能极大地降低对皮肤的刺痒，提高棉 麻织物的服用性能及产品档次。
凝胶过滤
• 凝胶过滤层析法是根据蛋白质的大小和形状，即 蛋白质的质量进行分离和纯化。 层析柱中的填料是多孔凝胶填料，多是交联的聚 糖类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小 的不同进行分离，一般是大分子先流出来。小分 子后流出来。 具有条件温和,简便,分离范围广,回收率高等特点
王玢等人对海洋细菌产生的纤维素酶粗酶液进行 盐析，透析并分别过葡聚糖凝 胶 层 析 柱 SephdedxG 89 ,SephdedxG50和 SephdedxG75,结果显示SephdedxG75 分 离效果最好。 贺刚等运用葡聚糖凝胶层析柱SephdedxG75 法对草鱼肠道一菌株产纤维素酶粗酶液进行分离 纯化，结果显示，分离纯化后酶的比活力提高了 2.92 倍，回收率为5.38%
除了上述方法，还有反胶束萃 取法，高效液相色谱，十二烷 基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶 电泳法等
食品工业 饲料工业
洗涤剂工业
纤维素酶
其他
应用
纤维素酶在食品工业应用极为广泛。 如将纤维素酶应用于豆腐生产工艺中，结果表 明，在大豆浸渍时添加0.5%~5.0%纤维素酶，可提 高4.00%~11.01%豆腐品率，且所产豆腐色质和风 味无明显变化，同时不改变原有生产工艺路线，其 经济效益比较明显 。
罗志强
孟豪轩
陈孟南的来源
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纤维素酶的分离提纯技术 纤维素酶的应用 纤维素酶的问题与展望
概念
纤维素是地球上最丰富的可再生性碳源物质 ，其降解是自然界碳素循环的中心环节，有效利 用纤维素可有效解决能源危机，可以用于生产大 量化工原料，如乙醇，丁醇等，采用纤维素酶进 行水解是保证无污染地将这些纤维素物质转化成 简单糖的关键。 纤维素酶的组分复杂，主要有内切葡聚糖酶，外 切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶3种。给纤维素酶的分 离纯化带来了一定的困难。
3.纤维素酶的应用领域应进一步拓宽。
（一）分子量：45000-76000； 最适pH：pH4-5；最适温度： 40-60℃ 。 （二）纤维素酶各组分大多为糖 纤维素酶的分子结构 蛋白。 （三）纤维素酶是诱导酶，诱导 物为纤维二糖。
纤维素酶
昆虫
真菌
软体动物
纤维素酶
原生动物
放线菌 细菌 目前研究较多的是霉菌，其中酶活力较强的菌 种为木霉、曲霉、根霉和青霉，特别是里斯木霉、 绿色木霉、康氏木霉等较为典型，是目前公认的较 好的纤维素酶生产菌。
通常采用的中性盐有
硫酸铵、硫酸钠、硫酸
钾、硫酸镁、氯化钠和磷
酸钠等。
纤维素酶的分离纯化多采用硫酸铵分级沉淀法，因 为硫酸铵具有溶解度大，对温度变化不敏感，分级 效果好等特点。
陈红漫等在芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶的分离纯化及特 性的研究中采用硫酸铵分级沉淀法对粗酶液分离纯 化，结果显示在硫酸铵饱和度区间为20%~60% 时，经硫酸铵沉淀后，酶纯化倍数为 1.42，回收 率为 11.41%。
纤维素酶在造纸、草药提取等方面均有很 大应用潜力。用纤维素酶适当处理纸浆，能增加 微细纤维生成量和提高保水度，有可能促进某些 纸张抗张力提高。
1.纤维素酶作用机理有待进一步研究，由于纤维 素酶的空间结构复杂，加之纤维素酶不易分离纯 化、结晶难，应进一步在分离纯化技术和研究方 法上进行突破。
2.目前纤维素酶的产量和活性都不高，成本偏高， 今后应加强菌种选育和发酵工艺等基础研究工作， 分离和筛选出针对不同行业的高效纤维素分解菌 群。
纤维素酶的分离纯化
纤维素酶的组分大多为糖蛋白，工业上用于生 产纤维素酶的粗酶制剂常采用硫酸铵沉淀法，酒精 沉淀法，丹宁沉淀法和离心喷雾干燥等方法。但 在纤维素酶的分析研究上个常采用一些列的蛋白 质分离纯化技术，如分级沉淀法，凝胶过滤法等。
沉淀法（盐析）
☻盐析沉淀法的原理：
高盐浓度下盐离子与酶蛋白质分子争夺水分 子，除去蛋白质的水合外壳， 降低溶解度而沉淀。
等电聚焦电泳法
等电聚焦电泳是依据蛋白质分子的等电点不同#在 一个连续的，稳定的线性pH梯度中电泳的蛋白质 分离和分析技术，等电聚焦电泳具有很高的分辨 率，可以分离等电点相差 0.01~0.02个pH单位 的蛋白质。
双水相体系萃取法
双水相体系萃取是利用两种聚合物或多聚物在水 相中的不相溶性，形成两相，两相对蛋白质分子 的亲和能力不同，达到从样品溶液中直接分离纯 化蛋白质的目的，也可起到浓缩蛋白质的作用。 双水相体系萃取具有条件温和"产品活性损失少， 处理量大，设备投资小，操作简单，易于放大及 连续操作等优点，广泛应用于蛋白质，酶，核酸 及多糖等生物大分子的分离纯化。 舒国伟等运用双水相萃取技术对纤维素酶进行萃 取，结果表明，在聚乙二醇4000——硫酸铵双水 相体系中，双水相体系的质量组成为硫酸铵8%， EG4000为26%,pH为4.8时,分配系数 K为 5.21，萃 取率为 79.4%
纤维素酶用作饲料添加剂,能明显提高饲料消化率 和利用率,促进动物生长。在奶牛的养殖上,纤维素 酶能增强奶牛食欲,增加其对粗饲料的采食量,提高 饲料的消化率和利用率,提高产奶量,同时,还能降 低奶牛消化道的发病率。
天然纤维如棉、麻等纺织品具有较强的吸湿、 透气性，备受消毒者青睐。但棉、麻及其混纺布料 上存在细毛，与皮肤接触时会产生刺痒感，因此近 几年来，利用纤维素酶进行生物整理越来越受到纺 织界的重视。利用纤维素酶进行酶处理，能使麻、 棉表面剥离和纵向复合细胞间层侵蚀，使纤维梢丝 束化或脱落，能极大地降低对皮肤的刺痒，提高棉 麻织物的服用性能及产品档次。
凝胶过滤
• 凝胶过滤层析法是根据蛋白质的大小和形状，即 蛋白质的质量进行分离和纯化。 层析柱中的填料是多孔凝胶填料，多是交联的聚 糖类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小 的不同进行分离，一般是大分子先流出来。小分 子后流出来。 具有条件温和,简便,分离范围广,回收率高等特点
王玢等人对海洋细菌产生的纤维素酶粗酶液进行 盐析，透析并分别过葡聚糖凝 胶 层 析 柱 SephdedxG 89 ,SephdedxG50和 SephdedxG75,结果显示SephdedxG75 分 离效果最好。 贺刚等运用葡聚糖凝胶层析柱SephdedxG75 法对草鱼肠道一菌株产纤维素酶粗酶液进行分离 纯化，结果显示，分离纯化后酶的比活力提高了 2.92 倍，回收率为5.38%
除了上述方法，还有反胶束萃 取法，高效液相色谱，十二烷 基磺酸钠——聚丙烯酰胺凝胶 电泳法等
食品工业 饲料工业
洗涤剂工业
纤维素酶
其他
应用
纤维素酶在食品工业应用极为广泛。 如将纤维素酶应用于豆腐生产工艺中，结果表 明，在大豆浸渍时添加0.5%~5.0%纤维素酶，可提 高4.00%~11.01%豆腐品率，且所产豆腐色质和风 味无明显变化，同时不改变原有生产工艺路线，其 经济效益比较明显 。