植物组织培养实验基本步骤

植物组织培养实验基本步骤

一、植物激素的配置

常见激素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚－3－丁酸（IBA）

1、生长素类：

（1）、生长素类在组织培养中的主要作用是：诱导细胞的分裂和根的分化，诱导愈伤组织

（2）、常见生长素：二氯苯氧乙酸（2，4－D）、萘乙酸（NAA）。NAA被广泛用于生根，2，4－D有利于愈伤组织的诱导和生长。IAA

容易光解，注意用棕色试剂瓶保存，保存时间不要太久。

（3）、溶解方法：用少量1mol/L NaOH或95％酒精预溶解，再加蒸馏水定容，以前者为好。

（4）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

2、细胞分裂素

组织培养中，细胞分类素主要促进细胞分裂和由愈伤组织上或器官上分化不定芽。细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。

（1）溶解方法：用少量（1ml）1mol/L HCL预溶解，再加蒸馏水定容。

（3）、保存：配成一定浓度后，冰箱冷藏保存

三、培养基的制备与灭菌

（一）、培养基的制备

1、将所需的各种母液和植物激素按顺序放好，将洁净的各种玻璃器皿等放在指定位置。

2、取烧杯一个内盛200ml蒸馏水，按照培养基配方所需量依次取母液和植物激素加入烧杯，搅拌，按相应培养基称量蔗糖和琼脂，并添加到烧杯中，在电炉上加热待琼脂完全融化后加蒸馏水定容至所需体积。

3、充分混合后，用1mol/LNaOH和1mol/LHCl调节培养基的pH为培养基要求pH值。

4、趁热把培养基分装到广口瓶中。封好瓶口。待灭菌。

（二）、培养基的灭菌

灭菌温度及灭菌时间：121℃（1.06kg/cm2）下灭菌20分钟。（如是实验所用菌材灭菌，如无菌水及器械，则是121℃（1.06kg/cm2）下灭菌30分钟）

1、检查灭菌锅外层锅内水位，水量过少时应加水。把分装好的培养基放入灭菌锅的消毒桶内。

2、盖上锅盖，注意按照说明操作并确定已盖好，设置好温度和时间参数，开启电源加热灭菌。

3、灭菌时间到后，先切断电源，让灭菌锅内温度自然下降，待灭菌锅压力表指针降到0时，打开排气阀，旋松螺栓，开启锅盖，取出已灭菌的培养基。

4、刚灭过菌的培养基成液体状，取出时不要用力摇动，否则会导致部分培养基沾附在瓶壁。放置在水平桌面上自然冷却。在室温下放置1-2天，观察有无微生物生长，以确定培养基是否彻底灭菌。经检查没有杂菌生长的方可使用。

四、无菌操作技术和接种

1、接种前，用75%酒精棉球擦拭超净工作台台面，将培养基及接种用具放入超净工作台台面，打开超净工作台紫外灯及接种房间紫外灯，照射约30min，然后关闭紫外灯。打开房间换气扇及微开超净工作台的玻璃挡板，通风20min后，即可进行无菌操作。（此步由专人统一负责）

2、接种室灭菌过程中同时对外植体进行表面灭菌。先将接种材料在流动的自来水下涮洗干净，吸干水份后切成大约70mm长的片段放进500ml烧杯中，用蒸馏水冲洗2次，倒掉蒸馏水后倒入0.1%的升汞水消毒，将材料淹没浸泡约10分钟（期间用镊子搅拌几次）。

3、把在消毒液中的接种材料转移到超净工作台上。用无菌镊子将已完成灭菌的接种材料转移到烧杯中，用无菌水清洗3次，每次不少于1分钟，洗时不断摇动烧杯以确保完全除去消毒液。

最后一次清洗后转移到无菌托碟上，将接种材料切成一定大小（花托0.5cm2、茎段0.5-1cm）。

4、取下培养瓶的盖子用火烧灼瓶口。用镊子将外植体轻轻插入到琼脂上，立即盖上盖子。

5、操作完后将镊子等器械浸入75%酒精中。操作器械需要在每次使用前消毒一次。方法是将浸于酒精中的器械取出后置于酒精灯火焰上充分灼烧，待冷却后方可使用。

6、将培养瓶放到培养箱里，在要求温度下培养，观察记录。