柠檬酸发酵微生物

• ④高产突变菌株的筛选 • 将诱变处理后的孢子悬浮液涂布在加富的察氏— 多氏培养基平板上，在35~37℃下培养，挑选出 孢子穗大而少的小菌落，
• 转接于8oBé麦芽汁斜面上， 35~37℃培养7~8d， 长满孢子后，制成孢子悬浮液；
• 将此孢子悬浮液移植于30ml的以柠檬酸钠为唯一 碳源的合成培养基中， 35℃静止培养18~24h， 两层薄宣纸过滤，滤去菌丝，滤液稀释（10-4~106），涂布如下标记培养基培养筛选。
黑曲霉积累柠檬酸基本条件
• 耐受高柠檬酸（15%以上）
• 耐受高浓度葡萄糖，粉浆浓度18%-20% • 对磷、锰、铁、锌等无机盐要求低
四、黑曲霉柠檬酸生产菌的保藏方法
• 两种情况 （1）随时供生产应用，要求菌种处于一种活 化状态；一般为斜面保藏。 （2）长期保存，要求菌种处于休眠状态，一 般有砂土管、石蜡封存法和真空冷冻干燥 法。 保藏的目的： 使菌种保持活力，同时还要保持其优良 的生产状态。
第四节 柠檬酸发酵微生物
• 一、柠檬酸发酵生产菌种 • 很多微生物都能产生柠檬酸， • 如黑曲霉（Asp.niger）、棒曲霉（Asp.claratus）、 文氏曲霉（Asp.nentic）、泡盛曲霉 （Asp.awamori）、芬曲霉（Asp.fenicis）、淡黄 曲霉（Perucillium.lutean）、桔青霉（P.citrium）、 二岐拟青霉（Paecilomyces）、梨形毛霉 （Mucor.picriforoms）等。
三、黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育及保藏 • 自然选育：在生产过程中，不经人工处理， 利用菌种自身的突变或直接从自然界中分 离筛选的过程。
• 诱变选育：通过诱变剂处理来提高菌种的 突变频率，扩大变异幅度，从中选出具有 优良性状的突变株。
• （一）黑曲霉柠檬酸生产菌的分离选育 • ①收集相当数量的现有菌种，经活化-分离-纯 化，从中挑选合适的菌株；
• （2）基因突变—向野生型退化的复壮 • 人工变异的菌种向野生型恢复突变
• 复壮方法和诱变育种相同，只是诱变计量 较低。
• （3）采用驯化—不经诱变处理的复壮 • ①采用酸性平板连续分纯：将退化菌种移 植于含有10%柠檬酸和10%薯干粉培养基 上连续分离纯化培养。 • ②将退化的菌种培养与经葡萄糖液浸泡的 含草根的泥土中，在泥土内加少量柠檬酸， 采用10%麦芽汁，0.2%蛋白胨培养液流动 培养 • ③用0.025~0.05mol/L盐酸刺激菌种，连续 培养 • ④采用固体、液体和含维生素的培养基交 替培养退化的菌种 • ⑤将孢子移接到种子培养液内24h后，在接 入发酵培养基内，能部分恢复活力。
（二）柠檬酸生产菌的诱变育种
诱变育种： 在人为地条件下,利用物理,化学等因素, 诱发生物产生突变,从中选择,培育成动植物和 微生物地新品种，进而设法从大量的变异群 体中筛选出优良的突变株的过程。
• 诱变剂-能提高菌种突变率的物质。 • 物理诱变剂：UV、氮离子注入、x射线等（染色体 水平上导致突变） • 化学诱变剂：（导致更细微的基因水平的突变） • 烷基磺酸盐和烷基硫酸盐：EMS甲基磺酸乙酯、 DES硫酸二乙酯 • 亚硝基烷基化合物：亚硝基乙基脲（NEH）、N-亚 硝基-N-乙基脲烷（NEU） • 亚硝酸（改变核酸结构和性质） • 叠氮化钠（可获得较高的突变频率）、环氧乙烷、 吖啶橙等。
• 衰退的原因： • • • • （1）环境条件：如培养基成分不适，温度过高； （2）移植菌株间歇时间过长，分离复壮时间间歇过长； （3）分离复壮效果差或杂菌污染； （4）连续传代次数过多或菌种有关基因发生自然突变或 者恢复突变。
（一）黑曲霉柠檬酸生产菌的分纯
• 平板划线法、稀释涂布法、小滴单孢子分离法 • 挑选具有以下特征的菌落： • （1）成熟时菌落中央稍隆起，出现绒毛状覆盖物 • （2）分生孢子梗短，分生孢子头大，圆形黑色， 老熟时开花状； • （3）次生小梗少，大部分不分枝。
（二）黑曲霉柠檬酸生产菌衰退的预防和复壮
• 1.衰退的预防 （1）采用新鲜斜面孢子
（2）减少传代次数
• （3）定期分离纯化
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• （4）采用孢子传代 • （5）生产选育
2.衰退的复壮 （1）营养成分引起衰退的复壮 不生孢子，只长菌丝，多为营养成份太 丰富所致； 可将麦芽汁、米曲汁浓度降低，也可添 加1/3大米粉或使用米饭、麸皮培养基
• 4.液氮超低温（-196 ℃ ）保藏法
• 以甘油、二甲基亚砜等作为保护剂，在液氮超低温 （-196℃）下保藏的方法。其主要原理是菌种细胞 从常温过渡到低温，并在降到低温之前，使细胞内 的自由水通过细胞膜外渗出来，以免膜内因自由水 凝结成冰晶而使细胞损伤。 • 适用于菌种的长期保存，-196 ℃远远低于微生物新 陈代谢作用停止温度（-130 ℃ ），此时菌体代谢 活动已停止。
• ④能抗微量金属离子，如Mn2+、Zn2+、Cu2+。
• ⑤在深层液体通风培养时，能形成大量的细 小菌球体，极大地降低发酵液的粘度。
• ⑥在以葡萄糖为唯一碳源的合成培养基上，生长不 好，生成小菌落，孢子形成能力弱。减弱葡萄糖通 过HMP途径（戊糖循环）降解的代谢流。
• ⑦在生长、繁殖期，细胞内具有较高水平的氨基酸、 NH4+;而蛋白质、核酸水平低。在生长和产酸期，细 胞内蛋白质，核酸水平低。 • ⑧具有很强的侧系呼吸链活性，此侧系呼吸链不产 生ATP。
• ③具体诱变处理
• 常用γ 射线源是60Co， • 将②中孢子悬浮液 • A.置于γ 射线下照射处理，照射后孢子悬浮液稀释， 取0.1ml涂平板。 • B.DES诱变处理，孢子悬浮液4.5ml，加入2%DES 0.5ml，与30℃振荡5min，再加入75% Na2S2O3 10ml，解毒10min或稀释10倍后涂平板。 • C.复合诱变，60Co γ 射线—高温处理—亚硝基胍处 理等，低剂量多次复合处理。
• （三）分纯、复壮菌种的质量要求 • • 14%薯干粉放入500ml三角瓶中，装液 量40ml，置于220r/min的旋转摇床上与 35℃培养4d，测定柠檬酸达到11%以上， 镜检菌丝粗壮，呈菌球体，无杂菌。
（一）黑曲霉（Asp.niger） 1.形态特征
2.生活周期
无性繁殖 孢子发芽
新孢子成熟 （约50h）
2.培养基
（二）解脂假丝酵母（Candida lipolytica） • 以烃类为碳源 • 1.形态特征 • （1）麦芽汁培养：25℃3d，卵形，基部出 芽。可能存在假菌丝、真菌丝及节孢子。 • （2）麦芽汁琼脂培养： 17℃1个月，菌落 奶油色，湿润或无光泽，柔软或粗糙，有 微皱或粗皱。 • （3）马铃薯或玉米琼脂培养：可形成丰富 的假菌丝和真菌丝，并出现芽生孢子，还 可能出现节孢子。
五、黑曲霉柠檬酸生产菌的纯化与复壮
• 衰退：菌种在培养或保藏过程中，由于自发突变的存在， 出现某 些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等 现象，称为菌种的衰退。 • 衰退的病症： • （1）菌种在扩大培养时，生长微弱或过度旺盛，产孢子 能力下降或丧失； • （2）发酵培养基和操作条件确信无异常情况下，产酸能 力下降或丧失； • （3）发酵液粘度升高，菌丝球形状、大小发生变化； • （4）平板分离检查无杂菌，但菌落大小有差别或异常， 甚至产孢子能力，孢子的颜色等也发生变化。
• 1.高产柠檬酸生产菌诱变育种 的步骤和方法 • ①一般选择具有一定产酸能 力，转化率高，产杂酸少， 对氧的需求、对原料的适应 性等方面良好的菌株为出发 菌株。 • ②孢子悬浮液制备：将孢子 转接与麦芽汁斜面上， 35~37℃培养7~8d，用生理 盐水将长好的孢子洗下，接 到营养丰富的培养基中，振 荡培养4~5h，孢子萌发，分 离。用pH6.0Tris缓冲液洗涤 一次，转到小三角瓶中，用 玻璃珠振荡打散，通过脱脂 棉过滤，制成单孢子悬浮液。
• 3.真空冷冻干燥保藏法（广泛采用的方法）
• 简称冻干法； • 通常是用保护剂制备拟保藏菌种的细胞悬液或孢子 悬液于安瓿管中，再在低温下快速将含菌样冻结， 并减压抽真空，使水升华将样品脱水干燥，形成完 全干燥的固体菌块。并在真空条件下立即融封，造 成无氧真空环境，最后 • 置于低温下，使微生物 • 处于休眠状态，而得以 • 长期保藏。 • 使孢子始终处于低温、 • 干燥、缺氧的条件下。 • （1~10年）
• 3.摇瓶筛选 • 从分离平板上，挑出单一菌落，移接到麦 芽汁琼脂斜面上，在33℃培养6~7d； • 孢子长好后，分别接入2环于三角瓶中，进 行摇瓶发酵试验，35~37 ℃、300r/min、 发酵60~70h； • 用针头注射器抽取发酵液1ml，用0.1mol/L NaOH滴定，产酸高者再进一步测定柠檬酸 产量。 • 从中筛选出产柠檬酸高、糖转化率高且产 酸稳定的菌种。
1.黑曲霉柠檬酸高产菌的形态特征
• 黑曲霉柠檬酸高产菌的形态 特征 • 1.在米曲汁或麦芽汁培养基 上菌丝白色，不是绒球状， 凸起，边缘整齐，菌落较小， 带褶皱。 • 2.在麦芽汁培养基上生长4 天成熟的孢子呈黑褐色。 • 3.在察氏培养基上生长较快 （10~14天），菌落边缘整 齐，分生孢子梗短，分生孢 子着生较密。
2.黑曲霉柠檬酸高产菌的生理特征
• ①能耐高浓度柠檬酸（15%以上），而不利用和分 解柠檬酸。 • ②耐高浓度葡萄糖（18-20%）；能产生和分泌大量 的酸性α -淀粉酶和酸性糖化酶，糖化酶最适作用 pH在4.0~4.6，最适温度为60~65 ℃。
• ③能利用淀粉质、糖蜜、葡萄糖母液等原料 发酵生产柠檬酸。
采用不同原料所用菌种不同
• 淀粉原料：TD-01,初糖浓度20.8%，96h，产酸率 20.24%，转化率97.28%. • 薯干原料：上海工微所→东酒2号→N-558 →Co827 →T419 • 初糖浓度18-19%，60-90h，产酸率20.24%，转化 率97%。 • 糖蜜原料：川柠-17-66（四川食品研究所），8668 （黑龙江轻工所），产酸14%，性能粗放，抗金属 离子能力强，以甘蔗蜜糖不需要黄血盐预处理。
• • • • •
（一）保藏的方法 1.斜面低温保藏法 2.载体吸附保藏法 3.真空冷冻干燥保藏法 4.液氮超低温（-196℃）保藏法
• 1.斜面保藏法 • 菌种孢子移接于麦芽汁琼脂斜面 后，在35 ℃下培养7~8d，待长满黑 褐色孢子后，放在2~4 ℃冰箱中保存， 可保存2个月
• 2.载体吸附保藏法 • 将菌种吸附固定在适当的载体上，进行干燥 保藏。 • 载体：砂土，麸皮，谷粒，麦粒，硅胶，粒 状活性炭，滤纸等。 • 柠檬酸常用的有：砂土管保藏法（3~5年）、 粒状活性炭保藏法（2年）、麸皮保藏法（10 年）
• 2.培养基
二、黑曲霉柠檬酸高产菌的形态特征和生理 特征 • 黑曲霉是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉 酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄 糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。 • 黑曲霉在pH为2～3的环境中发酵蔗糖，产物 以柠檬酸为主，只产极少量的草酸；当pH接 近中性时则大量产生草酸， 而柠檬酸产量很 低。
• ②采集大量的含菌样品，分离筛选出优良菌 种。根据黑曲霉的酶系特征，可以从腐烂植 物、水果表皮，也可从含有腐烂未熟水果的 酸性土壤中分离。
1.纯化培养 • 分离筛选黑曲霉柠檬酸生产菌常用培养基：
• 麦芽琼脂、米曲琼脂、马铃薯琼脂、察氏琼脂等。
• 2.纯化方法 • 采用平板划线分离、平板稀释分离和小滴分 离纯化培养，反复进行数次。