酶活性的测定方法

生物样品预处理

预冷解剖用具，采用颈后断头的方法将鱼杀死，立即取肝脏、腮、脑，操作均在4℃下进行，用预冷的0.15 mol/L KCl 溶液洗去血丝，用滤纸吸干后称重。

将肝、脑组织放入预冷的Tris-HCl缓冲液(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L KCl)匀浆（匀浆比（W/V）1:5），腮组织放入组织匀浆（匀浆缓冲液含40mmol/L咪唑，250mmol/L蔗糖，5mmol/L EDTA，pH7.0），匀浆比为1:40，匀浆速率为10000g，以15s为周期，重复3次。

分别取1ml匀浆液放入1.5ml离心管进行离心，4℃下离心(9000g，20min)，取上清液-80℃下保存，待测。

（1）250mL 0.15 mol/L KCl：取2.7956g

（2）Tris-HCl缓冲液：125mL 0.1 mol/L Tris（1.5143g）+ 105mL 0.1 mol/L HCl+ KCl（0.15*0.23*74.55=2.5720g）

（Na+＋K+）－ATPase活性的测定

1、试剂

（1）匀浆液（250ml）：40mmol/L咪唑0.6808g+250mmol/L蔗糖21.3931g +5mmol/LEDTA 0.3653g

（2）反应缓冲液（250ml）：80mmol/L咪唑 1.3616g+4mmol/LMgCl2 0.2033 g+40mmol/LKCl 0.7455g

（3）16mmol/L Na2ATP（10ml）：0.0988g

（4）30%三氯乙酸（TCA）9g TCA+21mlH2O

（5）定磷试剂（硫酸亚铁-钼酸胺试剂100ml）：10ml 5mol/LH2SO4+1.3556 g钼酸铵+90mlH2O

每10ml加入FeS040.5g（FeS04·7H2O 0.0941g），25ml加入FeSO4·7H2 O 0.2353g，临用前配制。5mol/LH2SO4：2.7ml H2SO4+7.3mlH2O （6）1mmol/L乌本苷（100ml）：0.0767g

（7）50µg/mL磷标准溶液（1000ml）：0.2195gKH2PO4

2、无机磷标准曲线的绘制：各试管分别加磷标准溶液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00m1及蒸馏水1.00、0.80 、0.60、0.40、0.20、0 m1，混匀后各吸取0. 08ml加入酶标板，同时加入0.08mlTCA，0.08ml定磷试剂，混匀后650nm处比色测吸光值。

3、酶活性测定

ATPase制剂：匀浆比（W/V）为1:40，离心10min（9000r/min）取上清液得到。

总酶活：酶液10µ1+反应缓冲液40µl+H2O 20µ1+ Na2ATP 10µ1（空白用H O代替Na2ATP，空白仍需加入酶液）。25℃保温15min后加入冷的30%TCA80 2

µ1终止反应+定磷试剂80µ1，静置5min后读数。

Mg2+-ATP酶活：酶液10µ1+反应缓冲液40µl+H2O 10µ1+乌本苷10µ1+ Na2 ATP 10µ1，其余同总酶活性测定。

4、蛋白质含量测定

1:40匀浆后1:5稀释测蛋白。

5、计算

10µl蛋白质含量：X*5*10 µg

Pi浓度计算：有标准曲线得Y µg/ml

10µl酶液的量：m= X*0.08 ml

Pi的物质的量：n=m/M=m*103/31 nmol

ATP活性：n*4/蛋白质含量= X*0.08*103*4/31 µmol/mg pro/h

SOD酶活性测定

1、试剂

（1）Tris-HCl 缓冲液

0.1mol/l的盐酸：取浓盐酸（密度为1.18，36%）8.4ml，加双蒸水稀释至1000ml。

0.1mol/l 的Tris 溶液：取6.057 克Tris，加水溶解，配成500ml。Tris-HCl 缓冲液（pH 为8.4，浓度0.1mol/l）：取86ml 0.1mol/l 盐酸，取250ml 0.1mol/l 的Tris 溶液，加双蒸水稀释至500ml。

（2）10mmol/l HCl：取0.1mol/l的盐酸10ml,加双蒸水稀释至100ml。

（3）6mmol/l 邻苯三酚(精确)：用10mmol/l HCl 配制。0.07567 g+100ml

10mmol/l HCl。

2、邻苯三酚自氧化速率的测定

邻苯三酚自氧化速率的测定：在酶标板孔中加入300μL Tris-HCl缓冲液，放置酶标仪中25℃恒温10min，加入预热的邻苯三酚及10μL双蒸水，在420nm处每30s 测定一次吸光值，自氧化速率在3 分钟内有效。调整邻苯三酚用量，使线性范围内吸光度值的变化速率控制在0.020OD/分。(注：实验时要确定邻苯三酚的用量，可先做8、9、10μL各两个)

3、酶活性测定

SOD活性测定与步骤2相同，只是将双蒸水换成同体积酶液。在420nm 下，每隔30 秒钟测吸光度值一次，计算平均每分钟的吸光度变化值△A420/分。控制SOD 样品液的稀释倍数，使稀释后的样品加入测定体系后，使邻苯三酚自氧化速率的吸光度值逐渐下降，即联苯三酚自氧化速率被抑制50%左右。注：取组织匀浆时，可先做1、3、5 倍稀释管各两只，以确定稀释倍数。（参考：将1:9匀浆液再稀释20倍用以测定鱼肝酶活。

（3）计算）

SOD 活力单位定义：在规定条件下，1ml反应液中，每分钟抑制联苯三酚420nm下自氧化速率达50%时的酶活力单位（U）或称Marklund 单位。样品液中每mg蛋白的总SOD活性单位数称为样品液的SOD 比活。

SOD活力(U/ml)= (0.020-△A420)/0.020×100% /50%×V总/ （V 定义·V 样）×样品稀释倍数

V 总：反应总体积3（ml）

V 样：加入样品液的体积3（ml）

V 定义：酶活力单位定义体积1（ml）