第六章_酶分子修饰

（3）酶的主要动力学性质的不适应
（Km值大，与底物的亲和力小）
米氏常数Km值过大，使反应在低底物浓度下不能 高速进行，由于体内各种代谢物质的浓度较低， 对Km较大的酶用于临床检测或治疗时，影响就更 大。
（4）临床应用的特殊要求
绝大多数酶来自动、植物及微生物，对人体来说 这些酶都是外源蛋白质，具有抗原性，都有可能 引起人体的过敏反应。
可与酶蛋白侧链上的羧基发生反应的小分子化合物， 发生羧基酯化、酰基化，或结合生成其他物质，改 变酶pr.的空间构象，从而改变酶的某些特性和功能。
修饰剂: 碳化二亚胺（CDC）、乙醇-HCl、异恶唑 盐、甲醇－HCl酯化
含有羧基的氨基酸：天门冬氨酸、谷氨酸等
3、胍基修饰剂
精氨酸残基含有一个强碱性的胍基，很难被修饰， 而一些二羰基化合物能够在中性或弱碱性条件下 与精氨酸反应。
第六章 酶分子修饰
一、酶分子修饰的原因
酶在生物技术中占有核心地位 酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件温
和等优点，在工业、农业、医药等方面得到越 来越多的应用。
大规模应用的酶及酶工艺尚不够多，导致这种现 象的原因是多方面的，这主要表现在：
(1) 稳定性
酶是生物活性大分子。一旦离开生物细胞，离开 其本身特定的作用环境，在发酵分离提纯、反应、 制剂及固定化等过程中，常常显得不够稳定，不 能适应大量生产条件的需要。
3）修饰：
活化后的大分子修饰剂与经分离纯化的酶液，以一 定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反 应，使两者以共价键结合。 4）分离：
通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度 的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰 酶。
右旋糖苷————（高碘酸HIO4）活化右旋糖苷
三、大分子修饰的作用
二、酶的分子工程
（一）基本内容
1、酶分子改造：
对酶蛋白的主链“切割”，即根据酶的结构与功能的研究， 通过一种相应的方法，去掉酶分子那些与活性无关而有碍 应用的部分，提高其活性，增加稳定性。
2、酶分子模拟：
根据酶作用原理的研究，模拟酶的活性中心和催化机制， 用化学合成的方法制备高效、专一、分子较简单、较稳定 的新型催化剂。（模拟酶）
（2）作用的最适条件
（pH中性、室温，溶液状态） 一般酶反应是在基本接近中性，与室温相距不大 的水溶液中进行的。 在工业应用上，由于产物、底物带来的影响，作 用时的pH常常不在中性范围内。 温度升高，酶促反应速度加快，但酶往往不稳定， 如果降低温度，又影响反应速度。 底物不溶于水时，酶就更难发挥作用。
如：精氨酸酶经PEG结合修饰后，其抗原性显著降低。 色氨酸酶经PEG修饰后可完全消除其抗原性。 L-天门冬酰胺酶经PEG结合修饰其抗原性完全消除。
第三节 酶分子的侧链基团修饰
采用一定的方法使酶分子的侧链基团发生改变，从 而改变酶分子的特性和功能的修饰方法。
修饰方法主要有：
氨基修饰
酚基修饰
羧基修饰
通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶 的结构。人们用化学法或酶法对酶的一级结构进 行改造。
包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将 肽链切断或部分切除，使酶的空间构象更为稳定。
另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即酶 的化学修饰。
（三）酶的化学修饰
蛋白质的化学修饰：通过化学基团的引入或除
3、增强酶的稳定性 如: Fe-SOD→Mn-SOD,对H2O2稳定性增强,对NaN3敏感性 显著降低
4、改变酶的动力学特性 包括Km与最适pH和最适温度等
四、常用的金属离子
二价离子：Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+， Cu2+，Fe2+等。
第二节 大分子结合修饰的作用
一、概念：
酶进入人体后也常会由于一些蛋白酶、抑制剂或 抗体的作用而失去其活力，特别是当酶进入体内 以后不能迅速到达或集中于病灶时，这种情况尤 为明显。
总结: 解决的问题 ？
（一） 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性? （二）如何保护酶活性部位与抗抑制剂? （三）如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水
解酶? （四）如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境?
（1）提高酶活力（空间构象改变）
一分子RNA酶 + 6.5分子右旋糖苷——酶活提高为 原来的2.25倍。
一分子胰凝乳蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活 提高原来的 5.1倍。
一分子胰蛋白酶 + 11分子右旋糖苷——酶活提高 0.30倍
（2）增加酶的稳定性
酶的保存或使用一段时间后，由于各种因素影响，原 来完整的空间结构受到破坏，酶活力降低，甚至完全 丧失催化能力。
2－羟基－5－硝基苄溴（HNBB）和4－硝基苯硫 绿可以比较专一地对吲哚基进行修饰，但也可以 与巯基反应。
8、分子内交联修饰
含双功能基团的化合物（双功能试剂）与酶蛋白 分子中相距较近的两个侧链基团之间形成共价交 联，从而提高酶的稳定性的修饰方法。
如：戊二醛、已二胺、葡聚糖二乙醛
戊二醛可以两端都含有醛基，可以与酶分子中的氨基 反应形成酰胺键或者与羟基反应形成酯键。
PEG生物相容性已通过美国食品和药物管理局 (FDA)认证。特别是当酶经过PEG类修饰剂修饰后， 修饰剂的许多优良性质也会在修饰蛋白中得到体现。
PEG分子末端有两个能被活化的-OH基团，化学 修饰时则多采用甲氧基聚乙二醇(MPEG)的衍生物 为修饰剂（只有一个可被活化的羟基）。
PEG分子量范围很宽，适合用作修饰剂或修饰剂出 发原料的PEG的相对分子质量一般为500～20000。
聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物：
是MPEG的羟基与琥珀酰亚胺类物质反应。在pH7-10时， 对酶的氨基进行修饰。
聚乙二醇胺类衍生物：
是MPEG的羟基与胺类化合物反应生成的。可以对酶的羰 基进行修饰。
聚乙二醇马来酸酐衍生物：
MPEG的羟基与马来酸酐反应生成共聚物（PM），其中 马来酸酐通过酰胺键对酶分子的氨基进行修饰。
三、步骤
1）酶分离纯化 2）除去原有的金属离子：
酶液中加入一定量金属螯合物，使酶分子中的金属 离子与EDTA形成螯合物，此时酶成为无活性状态。 通过透析或超滤、分子筛层析等方法，可将EDTA金属螯合物从酶液中分离除去。 3）加入置换离子：
用不同的金属离子加到酶液中，酶蛋白与金属离子 结合。
作用：
3、酶的化学修饰：
即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化 学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价 连接，从而改变酶的酶学性质的技术。
（二）酶的分子工程分类
1、分子生物学水平
利用工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以 期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合 理的酶蛋白。
2、蛋白质水平
去，而使蛋白质共价Fra Baidu bibliotek构发生改变。
酶的化学修饰：利用修饰剂所具有的各类化学
基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分 子上的某种氨基酸残基（一般尽可能选用非酶活 必需基团）产生化学反应，从而改造酶分子的结 构与功能。
酶化学修饰的方法
（一）金属离子置换修饰 （二）大分子结合修饰 （三）酶分子的侧链基团修饰 （四）肽链有限水解修饰 （五）氨基酸的置换修饰 （六）核苷酸链剪切修饰 （七）物理修饰
1、阐明金属离子对酶作用的影响 2、提高酶活力
如:将其它杂离子型的α-淀粉酶都换成钙离子型,会提高酶活 力与稳定性;结晶钙型α-淀粉酶活力比一般结晶杂离子型 α-淀粉酶活力提高3倍以上，稳定性也大增。 蛋白酶(锌型，Zn2+): 用Ca2+置换Zn2+成钙型蛋白酶，钙型 蛋白酶活性提高20~30%。
利用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶 的空间结构发生改变，从而改变酶的特性与功能的 方法。
二、方法（步骤）
1）修饰剂的选择：
水溶性大分子修饰剂有：右旋糖苷、聚乙二醇、 肝素、蔗糖聚合物、葡聚糖、环状糊精、羧甲基 纤维素、聚氨基酸等，根据酶分子的结构和修饰 剂的特性选择。
PEG特点：
溶解度高，溶于水，也溶于有机溶剂，没有抗原 性，也没有毒性，生物相容性好。
6、咪唑基修饰
修饰剂与咪唑基反应,使酶分子中的组氨酸残 基发生改变，从而改变酶分子构象和特性的修 饰方法。
咪唑基修饰剂有： 碘乙酸、焦碳酸二乙酯（DPC）
7、吲哚基修饰
色氨酸含有吲哚基，修饰后酶的构象与特性发生 改变。
修饰剂：N－溴代琥珀酰亚胺（NBS）可以对吲 哚基进行修饰。但酪氨酸有干扰作用。
衰期只有6～30 min
水溶性大分子结合法修饰SOD可使其在体内的稳 定性提高, 半衰期延长70—300倍
如：
半衰期 相对稳定性
天然SOD
6 min
1
右旋糖苷-SOD
7h
70
Ficoll(低分子量)-SOD 14 h
140
Ficoll(高分子量)-SOD 24 h
240
聚乙二醇-SOD
半衰期：酶活力降低到原来活力一半所经过的时间
例:尿激酶：治疗脑血栓，人体内半衰期只有2～20min
SOD: 属氧化还原酶类，能清除体内超氧负离子。 SOD具有保护DNA、蛋白质和细胞膜的作用，使
它们免受超氧负离子的破坏。 治疗：类风湿性关节炎、白内障、膀胱炎、红斑
狼疮、皮肤炎等。 SOD在体内稳定性差，静脉注射方式给药SOD半
酶对人体是一种外源蛋白，当经注射进入人体后 会成为抗原，刺激体内产生抗体。当这种酶再次进 入体内，抗体就会与作为抗原的酶特异结合，而使 酶失去催化能力。
抗体与抗原间特异结合是由于它们之间特定分子结构引 起的。用酶分子修饰法使酶的结构产生改变，抗体、抗 原就不再特异结合，可能降低或消除其抗原性。
利用水溶性大分子对酶进行修饰可降低或消除酶的抗原 性。
35 h
350
修饰酶热稳定性也可显著提高，且具较强的抗蛋 白酶水解，抗酸碱及抗氧化的能力。
例： L-天门冬酰胺酶：用聚丙氨酸结合修饰后，热稳
定性提高。 木瓜蛋白酶 + 右旋糖苷：显著增强酶抗酸碱，抗
氧化能力。
（3）降低抗原抗体反应
a. 抗原：能引起体内产生抗体的物质
b. 抗体：当外源蛋白非经口进入人或动物体内后， 体内血清就可能出现与此外源蛋白特异结合的物质
巯基修饰剂。
DTT
过甲酸
5、酚基修饰剂
蛋白质的酪氨酸残基上含有酚基。 修饰方法：碘化法、硝化法等 修饰剂：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。 例1：枯草杆菌蛋白酶的第104位的酪氨酸可特异
的被碘化、硝化和琥珀酰化，经修饰后的酶，由 于负电荷的引入则增加了对正电荷底物的结合力。
例2：
用HNO2修饰天门冬酰胺酶，使其氨基末端的Lys 和肽链中的Lys-NH2脱去变成羟基，经修饰后该 酶的稳定性大大提高，体内半衰期可延长2倍，显 著提高治疗效果。
目前关于精氨酸的修饰的研究主要集中在二羰基 化合物上。
Arg含胍基 + 二羰基化合物—— 生成稳定杂环 丁二酮，苯乙二醛，乙二醛，环已二酮
4、巯基修饰剂
两个巯基可以形成二硫键稳定蛋白质结构，由于巯基 具有很强的亲核性，巯基一般是蛋白质分子中最容易 反应的侧链基团。
修饰后，可显著提高酶的稳定性。 修饰剂：二硫苏糖醇、巯基乙醇、硫代硫酸盐等 5，5´ -二硫-2-硝基苯甲酸（DTNB）已成为最常用的
咪唑基修饰
巯基修饰
吲哚基修饰
胍基修饰
分子内交联修饰
1、氨基修饰剂
凡能使酶蛋白侧链上的氨基发生改变的化合物 修饰剂:
乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸、2,4,6-三硝基苯 磺酸（TNBS）、丹磺酰氯（DNS）、2,4-二硝基 氟苯（DNFB）等。 含有氨基的氨基酸：赖氨酸等
2、羧基修饰剂
2）修饰剂的活化：
水溶性大分子需经过活化才能与酶分子的某些侧链基 团进行反应。 常用的大分子修饰剂：单甲氧基聚乙二醇（MPEG） 不同类型的PEG衍生物：
聚乙二醇均三嗪衍生物 聚乙二醇琥珀酰亚胺衍生物 聚乙二醇胺类衍生物 聚乙二醇马来酸酐衍生物
聚乙二醇均三嗪衍生物： 是MPEG的羟基与均三嗪（三聚氯氰）反应活化而成，氯可对天冬酰 胺酶等酶分子的氨基进行修饰。
第一节 金属离子置换修饰
一、 概念
通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的 特性和功能发生改变的方法。
二、作用范围
含有金属离子的酶 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成 部分，对酶的活性起重要作用。
（ 1 ）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活， 重新加入原离子则酶复活。
（ 2 ）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则 可使酶呈现不同特性。