花青素提取工艺

黑大豆、紫薯花青素

一、提取工艺

1、黑豆：pH2.0，醇提黑豆为乙醇浓度60%，提取时间80min，提取温度50℃，料液比1:6，得率为84.21%；水提黑豆为提取时间80min，提取温度60℃，料液比1:8，得率达89.04%。反复提取5次。

2、紫薯：最佳条件: 物料比为1：20，用85：15 的酸化乙醇，置50℃恒温，提取60 min，重复2 次，提取率可达90% 以上。

二、纯化

酸醇提取物真空抽滤后用旋转蒸发器旋蒸去乙醇, 再用石油醚萃取3 次以除去脂类, 最后再真

空抽滤保证提取液无颗粒杂质，得到花色苷粗提物。将经过酸化的花色苷提取物导入Amberlite TM XAD-7 HP 型大孔吸附树脂柱中，流速1 ml/min，树脂完全吸附后用上样液50倍体积的酸化水冲洗，流速2 m l/min，再用80%酸化乙醇洗脱，流速1ml/min，当柱中流出液体不透光时用烧杯接入，直至液体开始透光后停止。将此溶液旋转蒸发后装入培养皿中，冷藏于- 80℃冰箱，冷冻2 h后，放入冷冻干燥机冻成干粉。以矢车菊素-3-葡糖苷为对照，经HPLC确定其纯度。

三、花色苷浓度确定

1、最大吸收波长的确定：对黑大豆、紫薯花色苷粗提液在200-600nm之间进行全波长扫描，可得到两种花色苷在可见光区的最大吸收峰，设为530nm左右。

2、标准曲线制作：取矢车菊-3-葡糖苷(cyaniding-3-glucoside，购于sigma，纯度>95%)标准品若干克，用蒸馏水配成0.12

3、0.108、0.086、0.069、0.049、0.035mg/ml（根据需要自行设定浓度梯度）。以蒸馏水为空白对照，在530nm波长处测定各提取物吸光度。以吸光度(A)为纵坐标，标品浓度(mg/mL)为横坐标，绘制标准曲线。得线性方程：y=6.519x一0.0449，R2=0.9989（R2尽量大于0.99）。以此线性方程我们可将吸光度值转换成花色苷浓度。

分别收集紫薯、黑豆各次浸提液，各测定其总体积。取一定量上层液体，5000rpm离心10min 后，取上层清夜在530nm下测吸光度。与标准曲线比较即可得出溶液中花色苷浓度。

将适量提取液用相应浓度的pH3. 5 的乙醇溶液定容至适当体积, 以对应的乙醇溶液作参比, 于535 nm处测A535nm值, 其计算公式为:

式中：MF—种皮花色苷质量分数，mg/g；A535nm—吸光值；V—定容体积，mL；N—稀释倍数；

98. 2—花色苷在535 nm 处的平均消光系数；m—黑大豆种皮质量，g 。

花色苷得率计算公式：

式中，n一样品的浓度；v一样品的体积；f一样品的稀释倍数；M一总花色苷含量。

四、氧化能力测定：

➢抗脂质过氧化法

➢总抗氧化能力（TAC）测定：FRAP法

➢•OH清除能力：邻菲罗啉-Cu2+-抗坏血酸(Vc)-H2O2体系

➢•O2-清除能力：邻苯三酚-鲁米诺-碳酸盐缓冲液体系

➢H2O2清除能力：H2O2-鲁米诺-碳酸盐缓冲液体系

➢抑制DPPH（1，1-二苯基-2-苦基肼自由基，有机自由基）能力

具体方法及原理请参看参考文献。

五、抗肿瘤细胞生长能力测定：MTT法

将对数生长期的MDA-MB-453肿瘤细胞以2. 5×105 /ml接种于96孔培养板，每孔200μl培养基，每组设3-6个平行孔，共6 组，培养过夜。

分别加入不同剂量花色苷提取物（0.2μm滤膜过滤），其终浓度分别为200、150、100、50 mg /ml，对照组加等量蒸馏水，培养24 h，每孔加入含1mg/mlMTT的培养基，3-4 h后吸去培养基，加入酸化异丙醇或DMSO溶解固形物后，酶标仪检测450 nm 处光密度值[ D (450) ], 以酸化异丙醇或DMSO溶液空白调零。抑制率= [对照D ( 450) -实验组D (450) ] /对照D ( 450) ×100%。（具体步骤还得看Protocal）