氧化葡萄糖酸杆菌生物制造吡咯喹啉醌进展

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinine ，PQQ ）是继吡啶核苷酸和黄素核苷酸之后，在许多细菌脱氢酶中发现的第3种氧化还原酶的辅酶。PQQ 可作为细菌脱氢酶（醇脱氢酶、醛脱氢酶、-葡萄糖脱氢酶以及甲氨脱氢酶等）的辅因子，是一种高度可溶及热稳定的化合物，能促进革兰氏阴性菌周质中醇类和糖类的氧化。X-射线对PQQ 结构进行解析显示[1]，该辅因子3个羧基和2个相邻醛基的醌类结构，喹啉环C4和C5位置上的醌在发生氧化还原反应时，可以被还原为酚，吡咯喹啉醌分子结构及3D 立体结构如下：

PQQ 广泛存在于革兰氏阴性菌及动植物体内，可以影响生物体的生理生化过程。研究表明，PQQ 具有以下作用：

（1）刺激微生物、人体细胞生长和植物发育[2-3]；（2）作为动物体的生长因子[4-7]；（3）防治肝损伤[8]；（4）清除自由基，保护机体[9-10]；（5）促进神经生长因子产生[11-12]；（6）信号转导的调节与脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid ，DNA ）修复功能[13-17]；（7）生物电化学中的应用[18-19]。由此可见，PQQ 在医药、化妆品、保健品、环境和食品领域具有广泛的应用潜力，需求空间巨大。因此，大规模制备PQQ 具有重要意义。据新思界产业研究中心统计，2014～2016年期间，中国PQQ 产量呈逐年缓慢递增趋势。2014年产量为1540.3kg ，2016年的产量为2056.5kg ，价格超过5万元/kg [20]。

随着医药、食品、农业等行业的发展及人们对PQQ 认识程度的加深，PQQ 产品的市场需求量将增加。另外，由于技术的进步，其应用范围也将扩大，进一步促使PQQ 产品的市场需求量增加。目前，全球市场需求100多吨，主要供应商是日本的三菱瓦斯化学。我国有部分企业做植物提取，但是PQQ 提取纯化难度非常高，而化学合成则程序繁杂、

污染严重、产率低、对环境易造成污染，应用于药物或食品

添加剂成本高，不适于推广。相比之下，生物法合成PQQ 具

氧化葡萄糖酸杆菌生物制造吡咯喹啉醌进展

胡鸿雨，孙晓明，袁建锋*

（浙江师范大学行知学院，浙江兰溪314100）

摘

要：吡咯喹啉醌（PQQ ）是继黄素核苷酸和吡啶核苷酸之后，在膜束缚的细菌脱氢酶中发现的第三种辅基，具有抗氧化、抗病毒和

提高免疫力等多种生理功能，在食品、医药及农业等行业具有广泛的应用前景。该文综述了氧化葡萄糖酸杆菌（）

中PQQ 的生理作用及生物合成的分子机制，表明了氧化葡萄糖酸杆菌作为出发菌株生产PQQ 具有潜在优势，对今后工业化生产PQQ

具有积极的指导意义。

关键词：吡咯喹啉醌；氧化葡萄糖酸杆菌；生物制造中图分类号：TQ92

文章编号：0254-5071（2019）06-0013-05

doi:10.11882/j.issn.0254-5071.2019.06.003

引文格式：胡鸿雨，孙晓明，袁建锋.氧化葡萄糖酸杆菌生物制造吡咯喹啉醌进展[J].中国酿造，2019，38（6）：

13-17.

HU Hongyu,SUN Xiaoming,YUAN Jianfeng*

quinone (PQQ),a third prosthetic group,was found in membrane-bound bacterial dehydrogenase following riboflavin and

pyridine nucleotide.It was wildly used in food,medicine and agriculture industry for its various physiological functions,such as antioxidant,anti-virus and immune function.In this article,the physiological role and molecular mechanism of biosynthesis of PQQ in were reviewed.Results showed that had the potential advantages for PQQ production.Hence,it has positive guidance significance for the

future PQQ industrial

production.

quinone;

;bio-manufacturing

收稿日期：2018-12-12

修回日期：219-04-12

基金项目：浙江省教育厅一般基金资助项目（KYZ04Y17068）；浙江师范大学实验技术开发资助项目（SJ201824）作者简介：胡鸿雨（1984-），男，讲师，博士，主要从事药物化学研究工作。

*通讯作者：袁建锋（1979-），男，讲师，博士，主要从事工业微生物代谢工程研究

工作。

有反应条件温和、合成过程易于控制、对环境无污染等优

点，是未来工业化生产PQQ的发展方向。氧化葡萄糖酸杆菌（）为革兰氏阴性菌，广泛存在于自然界中，该菌含有大量膜结合脱氢酶，并与呼吸链耦合作用，氧化有机物和醇类作为PQQ的生产菌，因此在工业上很适合作为研究的模式菌株。本文对氧化葡萄糖酸杆菌生物合成PQQ过程中涉及的遗传背景、分子机制以及代谢途径进行综述，并对未来研究重点进行展望，为工业化生

产PQQ做铺垫。

1自然界PQQ的分布

自从发现PQQ以来，它在自然界的分布引起了研究者的关注。PQQ几乎存在于所有的食品中，人体内脏、睾丸和体液中都存在PQQ，脾脏含量最高，达到5.9ng/g，母乳中PQQ及其衍生物总含量高达140～180ng/mL，比一般食物含量多几十倍，但目前还无法证实高等生物能自身合成PQQ[21]。自然界中一些革兰氏阴性菌具有合成PQQ的能力，研究发现，在不同的革兰氏阴性菌中PQQ合成量有所不同，有些细菌，如恶臭假单胞菌（），仅满足自身的生理代谢需求[22]；有些细菌却能大量合成PQQ 并分泌到胞外。迄今发现的野生菌包括：甲烷单胞菌属（）、交替单胞菌属（）、黄色杆菌属（）、不动杆菌属（）、甲基杆菌属（）、醋杆菌属（）、葡萄糖杆菌属（）、硫杆菌属（）、枝动菌属（）、弯杆菌属（）、嗜甲基菌属（）、生丝微菌属（）、精朊杆菌属（）等[23]。在这些微生物中，PQQ作为葡萄糖脱氢酶和乙醇脱氢酶的辅基，在底物与电子受体之间参与呼吸链电子传递作用，如氧化葡萄糖酸杆菌（

）、肺炎克雷伯氏菌（

）、绿脓假单胞菌（）、乙酸不动杆菌（）、扭脱甲基杆菌（

）、嗜有机甲基杆菌（

）、鞭毛甲基菌（）、耐辐射球菌（）等[24]。另外，自然界中还存在一些细菌，仅能合成醌蛋白酶类，而不合成PQQ，如大肠杆菌（），醌酶只有结合PQQ后才具有活性。由此可见，微生物具有合成PQQ的应用条件，而如何开发构建高效PQQ生物合成的微生物是当前研究者需

要重点解决的问题。

2氧化葡萄糖酸杆菌中PQQ的相关研究

2.1PQQ生物合成相关基因

PQQ合成途径的研究已有二十余年，期间已对多种微

生物的PQQ合成途径进行了基因簇标记，发现不同的微生物间存在一定的差异，如中PQQ基因簇为ABCDEF；中ABCDE 与F相互分离；AM1含有ABC/DE操纵子，其中C与D为嵌套基因，另外FG与其他基因独立成操纵子；

中仅有ABCDE基因簇，而不含有F基因等，PPQ生产菌及其基因簇排列情况具体见表1。

2005年，PRUST C等[25]对氧化葡萄糖酸杆菌

621H基因组进行测序，发现其PQQ主要是由ABCDE基因簇所编码，HOLSCHER T等[26]通过荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）证实了A的启动子为整个基因簇唯一的启动子。不同菌种A基因编码氨基酸肽链有所不同，一般为23～29个氨基酸残基，如

中为23个氨基酸组成；含有29个氨基酸；中包含27个氨基酸。即便如此，A 编码的短肽链结果仍比较保守，其中谷氨酸Glu和酪氨酸Tyr为两种保守残基氨基酸，结构为Glu-X-X-X-Tyr（X为任意氨基酸）[27]。另外，在中，A基因保守序列的定点突变，以及中A基因的移码突变都能终止PQQ的合成，进一步证实A基因中包含PQQ 合成的骨架序列。B基因编码一个300个左右氨基酸的蛋白，对其序列分析发现，该蛋白为锌指结构蛋白，属于金属--内酰胺酶类，且与磷酸二酯酶Phnp同源性最高。在PqqB蛋白活性中心与锌指结构之间还有一段甘氨酸序列，且包含一个常见于非血红素铁蛋白结构。研究表明，B 基因编码蛋白与Tyr的氧化[28]及PQQ的分泌[29]相关，但PqqB蛋白无疏水结构，不属于膜蛋白，因此，PqqB蛋白可能是间接参与PQQ转运。缺失PqqC蛋白的突变体中无法检测到PQQ，而体外实验表明，在在缺失PqqC蛋白的突变体无细胞体系中加入单独表达的PqqC，温育后则能检测到PQQ，说明C基因编码的蛋白主要负责催化最后一步反表1吡咯喹啉醌生产菌及其基因簇排列情况[22]

Table1Pyrroloquinoline quinone production strain and

its genes cluster arrangement

PQQ生产菌合成基因簇皮氏罗尔斯顿菌（）

鲍氏不动杆菌（）

肺炎克雷伯菌（）

氧化葡萄糖酸杆菌（）

醋酸钙不动杆菌（）

恶臭假单胞菌（）

台湾贪铜菌（）

塔斯马尼亚欧文氏菌（）

洋葱伯克霍尔德菌（）

A、D与ABCD

E与ABCD

ABCDEF

ABCDE

ABCDE

F与ABCDE

A、B2、D2E2与

ABCD

F与BCDE

E与ABCD