反义核酸抑制肝癌细胞生长的研究进展

ＮＡ）是一种细胞增殖必须的核抗原，是ＤＮＡ聚合酶８的重 要辅助因子，在ＤＮＡ复制、细胞增殖和细胞周期调控中发挥 重要作用，出现在所有增殖期的细胞核中，在细胞进入ｓ期 时表达，而处在Ｇ。／Ｇ。期细胞则基本不表达，因此将其作为 细胞增殖的标志‘引。ＰＣＮＡ在肝癌中呈高表达，与肝癌的分 期、分级以及预后有密切相关∞－４ｊ。将ＰＣＮＡ作为反义核酸 治疗的靶分子，特异性封闭ＰＣＮＡ基因表达，阻断ＤＮＡ合成 的共同通路，能够达到抑制肝癌细胞增殖的目的。ＰＣＮＡ反 义寡核苷酸序列与ＰＣＮＡ ｍＲＮＡ中ＡＵＧ起始密码子后的１８
பைடு நூலகம்ＤＮＡ
ＡＳ—
ＯＮＤ：５’一ＣＣＴＧＣＡＴＡ７ｒｃＡＧ从Ｇ从ＧＣＣＡＴ一３乞反义Ｓｔａｔｈ－
ｗｉｎ核酸反义寡脱氧核苷酸（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉ－
ｄｅ，ＡＳＯＤＮ）具有抑制ＳＭＭＣ－７７２１细胞生长的作用，而Ｓ・ ＯＤＮ（眈１１８ｅ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ，ＳＯＤＮ）无此作用。细胞 周期分布分析，ＡＳＯＤＮ作用后首先表现为Ｇ：／Ｍ期的阻滞， 在Ｇ，峰前出现凋亡小峰（ＡＰ峰），随后Ｇ２／Ｍ逐渐减少，ＡＰ 逐渐增多。ＡＰ峰的出现表明细胞ＤＮＡ降解、渗漏，导致 ＤＮＡ染色能力下降，提示凋亡的发生。ＡＳ－ＯＤＮ对ＳＭＭＣ・ ７７２１的生长抑制作用可能与其诱导肿瘤细胞凋亡有关。
某些肿瘤的发生与癌基因的激活和抑癌基因的失活有 关，它们都是正常细胞内存在的，其编码的产物多为信号传 导系统中的某些效应分子。癌基因和抑癌基因及它们的产 物在细胞正常生长和分化中发挥重要作用，他们的突变会造 成信号系统的紊乱，影响细胞的正常生命过程，从而引起肿 瘤。特别是某些癌基因编码生长因子或其受体，并以自分泌 的形式作用于瘤细胞，促进其生长，这是某些肿瘤无限生长 的分子基础。因此，许多学者企图用反义核酸抑制癌基因的 表达或自分泌生长因子的分泌或封闭其受体，来研究反义核 酸在肿瘤治疗中的作用。反义基因疗法是目前肿瘤基因治 疗中的一个重要方面。反义基因治疗就是应用反义核酸在 转录和翻译水平阻断某些异常基因的表达，以期阻断细胞内 异常信号的传导，使瘤细胞进入正常分化轨道或引起细胞凋 亡‘¨。 反义核酸包括三类：一类是将特异的反义基因连到特定 的表达载体上（质粒、病毒），导人靶细胞直接转录出反义 ＲＮＡ，与相应的ｍＲＮＡ形成双链，阻止ｍＲＮＡ作为模板进行 翻译而发挥作用。另一种类型的反义核酸是人工合成的寡 脱氧核苷酸（ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ），在机体内以胞吞的方式进 入细胞，与相应的ｍＲＮＡ结合发挥作用。第三种类型是核 酶，为一种具有催化活性的反义核酸，其与相应的ｍＲＮＡ结 合后能发挥酶活性将ｍＲＮＡ降解。反义核酸不仅能作用于 ｍＲＮＡ，阻止翻译过程，而且能特异地抑制转录过程。寡聚核 苷酸可以直接结合ＤＮＡ双链的特定部位，形成三聚体影响 转录因子的结合，使转录过程不能启动。寡聚核苷酸形成的 双链竞争转录因子的结合。
．———３０４．．．．—
ＣＣＧ ＣＴＡ ＣＡＴＧＧＣ ＣＴＧ
ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＬＡＰ）家族新成员啪Ｊ，其在多数
恶性肿瘤组织中过表达，但在相应正常组织中不表达，这种 选择性表达特性使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶 点¨１－３２］。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ是ＩＡＰ家族成员之一，该基因定位于人染 色体１７ｑ２５上一引，能通过ｃａｓｐａｓｅ依赖和ｃａｓｐａａｅ非依赖二条 途径来发挥抗凋亡作用Ⅲ】。与ＩＡＰｓ家族其他成员不同， ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因只表达于恶性肿瘤组织中，而在正常分化的成 人组织中无表达，即凋亡抑制因子表达具有肿瘤选择性的特 点，该特点使得靶向ｓｕｒｖｉｖｉｎ阻断治疗或基因治疗促进肿瘤 细胞凋亡疗法成为可能瞪嗡Ｊ，而且靶向治疗可选择性增加 肿瘤细胞对以凋亡为机制的治疗方法的敏感性，提高肿瘤病 人总体生存率。高萍等¨¨研究以凋亡抑制因子基因为靶 点，设计合成了特异性的针对ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因的ＡＳＯＤＮ序列。
２００９年
５反义Ｓｔａｔｈｍｉｎ核酸
Ｓｔａｔｈｍｉｎ是从淋巴瘤中筛选出的特征性的表达基因，为 一种高度保守的细胞内蛋白，在细胞周期过程中可被蛋白激 酶磷酸化，阻断Ｓｔａｔｈｍｉｎ磷酸化将使细胞分裂停止于Ｇ：／Ｍ 期泌蝴Ｊ。细胞内微管相关蛋白磷酸化过程中Ｓｔａｔｈｍｉｎ是重 要调节因子Ⅲｊ，影响细胞分裂及增殖。应用ＲＴ．ＰＣＲ方法在 肝癌细胞中检测到Ｓｔａｔｈｍｉｎ高表达，在此基础上张志伟等汹】 利用反义核酸技术抑制其表达，其活性被封闭后，ＳＭＭＣ． ７７２１细胞的增殖出现障碍，说明Ｓｔａｔｈｍｉｎ基因在维持ＳＭＭＣ． ７７２１细胞的生长中起十分重要的作用。基因序列全硫代修 饰为Ｓ－ＯＮＤ：５’一ＡＴＧＣＣＴＴＣＴｒＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＧ一３ ｊ
反义寡核苷酸与ＶＥＧＦ ｍＲＮＡ第３个外显子互补。反义序
用Ｎｏｒｄｌｅｍ杂交方法对ＴＧＦ－ａ、ＴＧＦ－Ｂ、ｂＦＧＦ和ＶＥＧＦ的 ｍＲＮＡ水平进行检测，发现ＶＥＧＦ及其受体是抗血管生成治 疗肿瘤的理想靶位。Ｓａｌｅｈ等【９’和Ｉｍ等¨训应用ＶＥＧＦ反义 核酸在裸鼠上进行实验，发现ＶＥＧＦ反义核酸技术能有效下 调肿瘤细胞的ＶＥＧＦ表达，抑制肿瘤的血管形成，有明显的 治疗作用。而且直接以肿瘤组织内皮细胞为靶细胞的抗血 管形成基因治疗可以避免长期使用肿瘤血管形成抑制因子 或促血管形成因子抗体可能诱导肿瘤出现的“耐药现象”，基 因治疗的靶向性明确，对正常组织血管形成的影响较小¨“。 另外，由于抗肿瘤血管形成基因治疗不受肿瘤细胞周期的影 响，故而是其他基因治疗方案的良好补充。
２血管内皮生长因子ｍＲＮＡ反义寡核苷酸
在已知２０多种血管生长因子中，只有血管内皮生长因 子（Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）专一作用于血管内皮细
胞，是最强和最特异的生长因子。大多数的肿瘤均表达高水 平ＶＥＧＦ【７ Ｊ，并与肿瘤的病理分期及预后密切相关。ＶＥＧＦ
列为：５’一ＧＣＡＧＴＡＧＣＴＧＣＧＣＴＧＡＴＡ僦一３：Ｓａｍｏｔｏ等”１
３
多药耐药基因ｍＲＮＡ反义寡核苷酸
多药耐药基因（ｍｕｈｉｄｕｒｇ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ，ｍｄｒｌ
ｇｅｎｅ）是跨
１增殖细胞核抗原ｍＲＮＡ反义寡核苷酸
增殖细胞核抗原（Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｎｇ
ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ
膜转运蛋白超家族的成员之一，在人类只有ｍｄｒｌ基因具有 产生多药耐药现象【ｌ“。在出现多药耐药的肝癌细胞中检测
４针对ＨＢＶ的ｐｒｅ—Ｓ２基因区翻译起始位点设计的 反义寡核苷酸
Ｓ基因区是ＨＢＶ的一个重要开放读码框架（ＯＲＦ），可分 为三个编码区，即前ｓｌ、ｓ２和ｓ区，其中前Ｓ２（ｐｒｅＳ２）基因编 码产物可介导ＨＢＶ进入宿主肝细胞中，研究已证实，ＨＢＶ阳 性的ＨＣＣ中以ＨＢｘ基因、ｐｒｅ－Ｓ２基因片段具有较高的整合 率¨“，预示ｐｒｅ．ｓ２基因片段与ＨＢｘ基因一样在ＨＣＣ的发生 发展中发挥重要作用。国外学者证明ｐｒｅＳ２／Ｓ蛋白是除ｘ 蛋白以外的第二种反式激活剂¨…。因而，利用反义核酸技 术封闭ｐｒｅ—Ｓ２基因特定位点，阻断ｐｒｅ・Ｓ２基因转录或蛋白表 达，理论上是预防ＨＢＶ感染及阻断感染后ＨＣＣ发生的有效 手段。该实验室的前期研究表明，针对ＨＢＶ的ｐｒｅ－Ｓ２基因 区翻译起始位点设计的反义寡核苷酸体外作用于ＨＢＶ
针对ｓｕｒｖｉｖｉｎ特异ＡＳＯＤＮ序列为：５’一ＣＣＣＡＧＣ唧・
达，流式细胞仪检测ＡＳＯＤＮ处理肝癌细胞ＳＭＭＣ－７７０１证实 ＡＳＯＤＮ能明显诱导细胞凋亡并抑制肝癌细胞增殖，
ＣＡＧＣＴＣＣＴｒＧ一３’。ＡＳＯＤＮ能有效地阻断凋亡抑制因子表
ｓｕｒｖｉｖｉｎ
提示采用基因技术封闭凋亡抑制因子蛋白表达，可解除凋亡 抑制因子对凋亡的抑制作用，诱导肿瘤细胞凋亡，达到治疗 目的。
ａｎｆｉｇｅｎ，Ｐｃ－
到ｍｄｒｌ基因的表达增高，机制是ｍｄｒｌ基因编码生产的Ｐ・ｇＰ 具有能量依赖性泵功能，可与多种药物结合以耗能方式排出 药物，降低细胞内药物浓度而产生耐药性¨引。反义核酸技 术可以针对性地封闭肿瘤发生发展过程中重要的基因，特异 性阻止基因的表达。已有研究证实反义硫代磷酸寡核苷酸 可以抑制人肝癌细胞株ｍｄｒｌ ｍＲＮＡ表达，部分逆转
第２９卷第２期 ２００９年４月
赣南医学院学报
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＧＡＮＮＡＮ ＭＥＤＩＣＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ
Ｖ０１．２９ ＮＯ．２ ＡＰＲ．２００９
反义核酸抑制肝癌细胞生长的研究进展
罗晓婷ｈ，黄勤岫，李舒梅ｈ
（１．赣南医学院ａ．生化与分子生物学教研室；ｂ．第一附属医院科教科；ｃ．科研中心，江西赣州３４１０００） 文献标识码：Ａ
ＭＤＲ¨“。但是，反义寡核苷酸易被细胞内ＤＮａｓｅ降解，高浓 度时对细胞毒性大，并抑制其基因的表达等不良反应¨”“。。 反义ＲＮＡ技术是利用基因重组技术，在适当的启动子和终 止密码子之间反向插入一段长为０．５～３．０ｋｂ靶基因序列，
．．．一３０３．－一
万方数据
赣南医学院学报
利用载体系统，使其在细胞内表达反义ＲＮＡ，以碱基互补原 则与靶ＲＮＡ杂交，抑制靶基因ｍＲＮＡ的翻译ｕ引。研究表明 ｍｄｒｌ基因起始密码子附近的外显子对形成Ｐ．ｇＰ三级结构有 重要作用Ｈ引。李波等¨７１试验设计的反义ＲＮＡ的靶区域是 ｍｄｒｌｍＲＮＡ５７端的起始密码子和部分外显子。结果表明肝癌 细胞对阿霉素的耐药性显著降低，流式细胞仪检测也表明细 胞膜Ｐｇｐ表达强度显著下降。因此，反义核酸是一种较为理 想的逆转肝癌细胞株ＭＤＲ的方法。 化修饰。
ＡＧ３’），设置随
７反义胰岛素样生长因子一Ｉ寡核苷酸
胰岛素样生长因子．Ｉ（ｉｎｓｕｌｉｎｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｄ，ＩＧＦ—Ｉ）是许
ＡＧＣＧＧＧＧＴＡ３’）作为对照，并进行硫代
万方数据
２期
罗晓婷，等反义核酸抑制肝癌细胞生长的研究进展
ｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｐｅｎｓ
多肿瘤细胞赖以生长的细胞因子，目前许多实验表明多种肿 瘤细胞１ＧＦ－Ｉ异常表达，在肿瘤的发生、发展中起重要作用， 它具有促进细胞有丝分裂、维持肿瘤细胞恶性转化和逃逸凋 亡作用ｍ功】。肿瘤细胞通过自分泌方式过度产生ＩＧＦ—Ｉ，从 而激活ＩＧＦ．Ｉ受体，而使自身不断生长，因此１ＧＦ－Ｉ成为反义 核酸治疗的良好靶分子。近年来发现ＩＧＦ－Ｉ可能是许多肿瘤 细胞生长的重要有丝分裂原，引起肿瘤细胞的分裂增生。乔 世峰等【舳３实验结果表明抑制ＩＧＦ．Ｉ的表达可以抑制肝癌细 胞的增生，并与肝癌细胞的分化相关。ＡＦＰ和ＣＥＡ是与肝 癌细胞生长相关的肿瘤标记物，与人肝癌细胞增生和恶性程 度有重要的相关性，胚胎期正常出现，细胞分化成熟后则停 止表达，血清ＡＦＰ及ＣＥＡ水平升高预示着肿瘤细胞在体内 增生活跃，因此可以作为反义ＩＧＦ．１寡核苷酸转染后肿瘤细 胞生物学变化的指标Ｈ“，评价其对肿瘤细胞的影响。针对 ＩＧＦ－Ｉ特异ＡＳＯＤＮ序列为：５’ＴＣＣＡＣＡＣＡＣＧＡＡＣＴＧＡＡＧＡＧ． ＣＡＴＣＣＡＣＣＡＧ３’。通过ＩＧＦ．Ｉ反义寡核苷酸转染肝癌细胞 后，肿瘤细胞分泌ＡＦＰ及ＣＥＡ水平明显降低，分别有非常显 著性差异（Ｐ＜０．０１）和显著性差异（Ｐ＜０．０５）．表明ＩＧＦ－Ｉ与 肝癌细胞的恶性程度相关。细胞凋亡是指在活组织中，由内 在基因编码调控的程序性细胞死亡过程，是机体一种正常生 理现象。细胞的凋亡决定细胞的死亡，肿瘤细胞凋亡说明机 体可通过自主地清除恶变的或可能恶变的细胞来对抗肿瘤 的发生和发展旧Ｊ。应用反义ＩＧＦ－Ｉ寡核苷酸转染可以使凋 亡的阳性细胞数量增加，诱导肝癌细胞凋亡。 反义基因疗法是目前肿瘤基因治疗中的一个重要方面， 它是应用反义核酸在转录和翻译水平阻断某些基因的异常 表达，以期阻断瘤细胞内的异常传导信号，使瘤细胞进入正 常分化轨道或引起细胞凋亡。肝癌是常见的恶性肿瘤，预后 较差。目前对于肝癌的基础研究及临床治疗仍是当今医学 领域热点之一。反义核酸能有效地抑制肝癌细胞的生长，为 开发肝癌生物治疗提供了实验基础，并通过探索其中的机 理，可望为肝癌治疗提供新的线索，为进一步的肝癌治疗相 关实验研究及临床治疗提供依据。 ［１４］ ［１１］
６反义Ｓｕｒｖｉｖｉｎ核酸
凋亡抑制因子（ｓｕｒｖｌｖｌｎ）是近年来发现的凋亡抑制蛋白 （ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ａｆ
ａｐｏｐｔｏｓｉａ
转染的ＨｅｐＧ２．２．１５细胞系，可有效抑制ＨＢｅＡｇ和ＨＢｓＡＳ的 表达（抑制率分别为９１％和６６％）啪Ｊ。刘素侠等Ｂ¨研究以 ＨｅｐＧ２．２．１５细胞接种裸鼠制备入肝癌模型，进一步探讨 鹪一ｐｒｅＳ２的体内抑瘤生长及抗病毒作用。研究结果表明， ∞－ｐｒｅＳ２＝种用药方式均具有良好的体内抑制瘤细胞生长作 用。反义寡核苷酸瘤内应用后，可使瘤组织生长缓慢，并可 观察到瘤组织病理损伤。流式细胞仪检测结果亦证实， 髂・ｐｒｅＳ２可能通过诱导Ｓ期细胞凋亡发挥抑瘤细胞生长作 用。混合用药与一次性给药方式均可使裸鼠的成瘤潜伏期 延长，并能有效降低荷瘤鼠的成瘤率，使瘤体生长缓慢。此 结果表明：ａｓ－ｐｒｅＳ２可有效抑制体内瘤细胞的生长，若应用于 临床治疗，早期用药疗效较好：若配合手术治疗肿瘤，有利于 手术后残余瘤细胞的清除，局部用药有望预防肿瘤的复发。 此外，混合用药组较一次性用药组效好，可能因混合用药时 药物较早进入瘤细胞发挥作用有关。另外，髓－ｐｒｅＳ２可有效 抑制体内ＨＢＶ抗原表达，与国外学者的研究结果类似口“， 但效果较体外实验差些Ⅲｊ，且没有明显的时相性，可能与体 内的药代动力学较复杂有关。船・ｐｒｃＳ２对荷瘤鼠的器官或组 织代谢无明显毒副作用。此研究提示，针对ｐｒｅＳ２基因起始 区的反义寡核苷酸对于防治ＨＢＶ感染及阻断ＨＢＶ感染后 ＨＣＣ的发生可能是一种安全有效的候选药物，具有潜在的临 床应用价值。反义寡核苷酸的合成与修饰：选择互补于ＨＢＶ ｐｒｅ．ｓ２基因翻译起始区的３２０３—３２１９位点为靶序列，ＰＣＲ合 成反义寡核苷核（５ＣＣＡ 机序列（５ＴｒＧ
中图分类号：Ｑ７８
文章编号：１００１－５７７９（２００９）０２—０３０３一０４ 位碱基序列互补‘引。反义序列为：５’一ＧＡＣＣＡＧＧｃＧｃＧｃ． ＣＴＣＧＡＡ一３：朱金海等‘６１选择ＰＣＮＡ作为反义核酸治疗的 靶分子，特别封闭ＰＣＮＡ基因表达，阻断ＤＮＡ合成的共同通 路，达到了抑制肝癌细胞增殖的目的。