发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR 反应条件的建立与优化

收稿日期：

2014-04-24基金项目：湖南省农业产业技术体系“湖南省生猪产业技术体系生猪

产业规模养殖与环境控制岗位”

作者简介：杜东霞（1981—），女，硕士，助理研究员，

主要从事环境微生物学及分子生物学研究。E-mail:xiaxia414@

*通信作者：贺月林E-mail:yyqhmm@

农业资源与环境学报

2014年10月·第31卷·第5期：

470-475October 2014·Vol.31·

No.5：470-475Journal of Agricultural Resources and Environment

随着规模化养猪产业的迅速发展，养殖场造成的环境污染问题显得日益突出。而发酵床养殖技术是依据自然生态理念和微生态原理，集畜禽粪尿无害化处理与科学饲养于一体的新型环保养猪技术[1]。该养殖技术是以猪舍内铺设谷壳、米糠、锯末等原料组成的基质垫料作为培养基，人为接种一些环境益生菌,猪饲养过程中所排放的粪尿在猪舍内经微生物原地发酵迅速降解、消化，从而达到零污染、零排放，从源头

实现环保、无公害的养殖目的[2]。

发酵床养殖技术的精髓是微生物的发酵和代谢作用，起主要作用的微生物群落结构十分复杂，除了发酵床垫料中的土著微生物外，还包含人为添加的一些功能微生物菌群，在饲养环境下，微生物在相互作用过程中，其群落结构和数量此消彼长，处于不断变化过程中，最终会产生一些优势菌群，主导着畜禽粪

便的无害化过程[1，3]

。因此，有必要弄清楚成分复杂的

发酵床垫料中微生物的种类、数量、亲缘关系以及群

落的演替规律，有助于开发出新型、高效、安全、稳定的微生物菌剂，促进发酵床养猪技术的进一步发展。然而，近几年来，发酵床垫料中的微生物群落动态及分子生态学的研究显得十分的薄弱，

一方面是由于许多功能微生物无法在实验室培养，

传统的微生物纯培发酵床垫料中微生物16S rDNA PCR 反应条件的建立与优化

杜东霞，尹红梅，张德元，刘

标，许隽，王

震，贺月林*

（湖南省微生物研究院，湖南长沙410009）

摘要：为探讨发酵床垫料中微生物16S rDNA 基因扩增实验中诸多因素对实验结果的影响，采用单因素法对16S rDNA 基因扩增时PCR 反应体系中的5个潜在因素（Mg 2+、dNTP 、引物、Taq 酶、模板DNA ）5水平上进行优化实验，并进一步优化了反应程序中的退火温度、循环次数。结果表明：25μL 的最佳反应体系为：10×PCR buffer 2.5μL 、MgCl 22.0mmol ·L -1、dNTP 0.2mmol ·L -1、引物0.2μmol ·L -1、Taq DNA 聚合酶0.5U 、模板DNA 50ng ；最佳反应程序为：在94℃下进行4min 预变性；随后循环扩增25个循环（包括94℃变性45s ，53.7℃退火30s ，72℃延伸90s ）；最后在72℃下延伸10min 。关键词：发酵床垫料；16S rDNA ；单因素法；退火温度中图分类号：

Q93-331文献标志码：

A 文章编号：2095-6819（2014）05-0470-06doi:10.13254/j.jare.2014.0102

Establishment and Optimization of Microbial 16S rDNA PCR Reaction Conditions in Fermentation Bed Padding Material

DU Dong-xia,YIN Hong-mei,ZHANG De-yuan,LIU Biao,XU Jun,WANG Zhen,HE Yue-lin *

（Hunan Academy of Microbiology,Changsha 410009,China ）

Abstract:In order to study the influence of several potential factors on 16S rDNA PCR reaction conditions in fermentation bed padding mate -rial,five factors （Mg 2+,dNTP,primer,Taq DNA polymerase and DNA template ）were optimized by single factor experiment at 5concentration

levels.Annealing temperatures and amplification cycle numbers were also optimized.The results showed that the optimum 25μL reaction system comprised 10×PCR buffer 25μL,MgCl 22.0mmol ·L -1,dNTP 0.2mmol ·L -1,primer 0.2μmol ·L -1,Taq DNA polymerase 0.5U and DNA template 50ng;and the optimum PCR procedure was as an initial pre-denaturing at 94℃for 4min,which preceded 25cycles of dena -

turing at 94℃for 45s,annealing at 53.7℃for 30s,and extension at 72℃for 90s,with a final extension at 72℃for 10min.Keywords:fermentation bed padding material;16S rDNA;single factor experiment;annealing temperature