功能蛋白质组学研究方法

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蛋白质芯片
蛋白质芯片是将大量蛋白质分子按预先设置的排 列固定于一种载体表面，形成微阵列，根据蛋白 质分子间特异性结合的原理，构建微流体生物化 学分析系统，以实现对生物分子的准确、快速、 大信息量的检测。
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• 蛋白质芯片反应结果的检测依据被检测蛋 白样品的标记种类来选择不同的检测设备。 荧光标记是芯片息采集中使用最多也是最 成功的报告标志。杂交反后的芯片上各个 反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫 描仪和相关软件可以进行分析，将荧光信 号转成数据，即可获得有关生物信息。
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这一技术有效地实现了基因型和表型的体外转
换，即在二者之间架起了联结的桥梁，使得研 究者完全可以在分子克隆的基础上，有效地实 现蛋白质构象的体外控制，从而可以在体外获 得具有良好生物学活性的表达产物。
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• Navagen公司用T7噬菌体构建的各种cDNA表达 文库，将外源基因序列插入到编码T7噬菌体包膜 蛋白基因中，插入片段基因长度可在300 bp ～3 000 bp之间，所表达的多肽或蛋白质以与噬菌体 包膜蛋白融合的形式展示在噬菌体表面，大小在 50个～1 200个氨基酸。
• T7噬菌体展示文库可以展示相当部分表达的蛋白 质，甚至可以保持蛋白的一定构象。因此，该系 统最大程度地再现了细胞内的真实情况，所筛选 出的结合蛋白与自然状态较为接近。目前已被成 功应用于蛋白质-蛋白质、抗原-抗体以及DNA-蛋 白质之间作用的研究，为功能基因组学的研究提 供了一种新的方法。
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抗体芯片
抗体芯片主要研究在不同生理或病理状态下蛋白质 水平的量变。微型化、集成化、高通量化是抗体芯片重 要特点。
芯片上排列了许多已知蛋白质的单克隆抗体，这些 单克隆抗体对应的蛋白质（抗原）都是细胞结构和功能 上十分重要的蛋白，涉及信号传导、肿瘤、细胞周期调 控、细胞结构、细胞凋亡等广泛的领域。
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SELDI-TOF-MS蛋白质芯片
表面加 强激 光 解 吸电 离 - 飞行 时间 质谱 (surface
enhanced laser desorption /ionization time of
flight-mass spectrometry，SELDI-TOF-MS ）蛋白质 芯片由３部分组成：蛋白质芯片、阅读器和分析 软件。 蛋白质芯片是核心部分，芯片上固定的介质可以 是阴离子、阳离子、疏水性、亲水性、金属等， 根据蛋白质的化学特性而有选择性地捕获特异的 蛋白质。
达蛋白质（living芯片） 。 4.将核酸固定在芯片介质中，然后利用不依赖细胞
的体外蛋白表达系统，在原位合成靶蛋白。
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液相蛋白质芯片
是一种新型的、高度灵活的多元蛋白质研究平台，可 以适用于蛋白质组研究、临床研究和药物研究中的各 种蛋白质分析。
• 液相芯片体系由许多不同的小球体为主要基质，每种 小球体上固定有不同的探针分子，将这些小球体悬浮 于一个液相体系中，就构成了一个液相蛋白质芯片系 统。在液相系统中，为了区分不同的探针，在球形基 质的制造过程当中，掺入了两种不同的红色分类荧光， 根据这两种红色分类荧光的比例不同(色彩编号)，区 分不同的探针。
功能蛋白质组学研究方法
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功能蛋白质组学是指对Baidu Nhomakorabea白质间、蛋白质 － DNA/RNA 间的相互作用的研究。以细 胞内与某个功能有关或某种条件下的一群 蛋白质为主要研究内容， 由此建立细胞内 外信号传递的复杂网络。
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• 蛋白质芯片技术 • 噬菌体展示技术 • 酵母双杂交系统
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蛋白质芯片分类
根据固定介质的不同,可以分为两大类: 化学型蛋白质芯片（SELDI-TOF-MS蛋白质芯片） 生物型蛋白质芯片（如抗体、受体、配体等）；
根据片基材料的不同可以分为： 膜芯片、玻璃芯片和液相芯片等。
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目前常用蛋白质芯片有： 1. SELDI-TOF-MS蛋白质芯片 2. 抗体芯片 3. 靶蛋白质芯片 4. 液相蛋白质芯片
• 可同时固定各种蛋白质、多肽、核酸等生物分子，可 以对同一个样品中的多个不同的分子同时进行检测。
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噬菌体展示技术
自1985年Smith G P等创建噬菌体展示技术，其 原理是：以经过改建的噬菌体为载体，把外源基 因插入噬菌体外壳蛋白基因PⅢ区或PⅧ区，从而 使表达的外源肽或蛋白质展示在噬菌体的表面， 并使表达产物保持良好的空间构象。进而通过亲 和富集法筛选表达有特异肽或蛋白质的噬菌体， 最终获得具有特异结合性质的多肽/蛋白质。
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• cDNA库是在噬菌体衣壳蛋白的基因中插入 从某些组织或细胞中抽提出来的mRNA的互 补DNA片段，从而表达该组织或细胞的各 种蛋白于噬菌体的表面。
如：抗体库的构建
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表达载体噬菌粒pCANTAB 5E
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噬菌体展示技术的应用
1. 与蛋白质相互作用的研究
有研究利用T7噬菌体展示筛选系统，以丝裂原 活化蛋白激酶（MAPK）信号转导通路中p38作 为靶蛋白，筛选了与其有结合关系的多肽或蛋 白，得到了46个编码蛋白的序列，在这些蛋白 中有激酶、转录因子、细胞骨架相关蛋白和离 子通道相关蛋白等。
抗体芯片检测的结果不是蛋白质的绝对含量而是目 的蛋白质在两个样品之间的相对峰度。
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靶蛋白质芯片
主要用于蛋白质相互作用研究、蛋白表达 研究和小分子蛋白结合研究。
靶蛋白质的获得： 1.化学合成； 2.基因工程表达蛋白质并进行纯化点样制作芯片； 3.将活的生物体(如细菌、酵母等)在芯片上原位表
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ＳＥＬＤＩ技术的基本原理:
将待测样品滴到芯片表面(血清、尿液、分泌液、 细胞裂解液等)，通过亲合作用样品中的某些蛋白 质被吸附到芯片的固相基质表面上，用缓冲液洗 去芯片上的杂质蛋白和其他污染物，然后在芯片 上 加 入 能 量 吸 收 分 子 （ energy absorbing molecular,EAM），芯片干燥后，在真空管中用激 光轰击，蛋白质在吸收能量后被解析发生离子化， 在电场力作用下脱离芯片表面， 被离子检测器所 检测。检测结果经过软件分析处理后， 可绘制出 质谱图，显示相关蛋白质的分子量、含量等信息。