蛋白质组学
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谱 （MALDI）电离方法
使得质谱可用于用于生物大分 子分析。此前，2-3个蛋白/年；现在 几百个/周。
8
样品（细胞、组织、体液） 图像分析、数据处理 2-DE
电转至膜上
ESI/MS/MS
胶上原位酶切
肽段混合物
PSD/MALDI/ TOF/MS
MALDI/TOF/MS 肽质量指纹图谱
Edman降解 氨基酸分析
➢ 技术角度，DNA可通过PCR体外扩增，蛋白不能，DNA 能高速准确测序，基因芯片非常成熟。
2
DNA 分析 (microarry) 与蛋白质分析方法(2-D & MS) 比较
灵敏度 方法 分子稳定性 重复性 消耗
专业化
自动化程度 修饰情况 动态范围
DNA
30 copy/sample (PCR) 高度特异（序列互补） 好 好 初期投入大 （chip、扫描仪， confocal)，但获得的数据多 成熟，标准化
N端序列
氨基酸组成
肽序列标签
数据库检索 蛋白质鉴定
库中不存在的蛋白质，可检索基 因组数据库（基因序列、EST转 成蛋白序列或反之）
寡核苷酸合成
蛋白实验
免疫组化
基因
蛋白活力（功能）
蛋白定位
蛋白质组数据库
多肽合成
抗体
9
§2 大规模的蛋白质提取、分离技术 蛋白质组提取、分离面对的困难： 样品中蛋白种类数目巨大；特性复杂。
14
1、 低丰度蛋白与膜蛋白的检测与分离技术
大部分蛋白质为低丰度蛋白质，但承担许多重要的生 物学功能比如：调控、信号转导等；
酵母基因组和蛋白质组研究结果表明，密码子偏性系 数（code bias index, CBI）小于0.2的蛋白为低丰度蛋白， 在酵母的6000余个蛋白中占一半；
（不同物种、不同生物体的密码子使用有着很大差异； 在不同物种中，类型相同的基因具有相近的同义密码子使 用偏性。）
6
➢ 用于翻译后修饰（磷酸化，糖基化等）蛋白质图谱展示 与检测的技术； ➢ 蛋白质芯片技术等。
7
质谱学领域的诺贝尔奖
1906年：物理奖 J. I. Thomson 磁质谱仪的基础同位素分析
1989年：物理奖 W. Paul 离子阱技术的发明；
2002年 ：化学奖 J. B. Fenn 电喷雾（ESI）电离方法 Koichi Tanaka 基质辅助激光解吸电离质
15
传统的2-DE很难检出低丰度蛋白 应对措施 ➢ 加大上样量 增大上样量的局限性：
高丰度蛋白的遮蔽作用； 负载量限制无限上样； 实验材料用量太大。
16
2-DE 上样量过大
17
蛋白质检出限于染色方法、起始加样量的关系
蛋白丰度 copy/cell
100000 1000 10
银染 蛋白的量
mg
0.002 0.201 20.07
18
19
成肌细胞 C2C12
20
Hale Waihona Puke Baidu C2C12分化108小时后，形成的肌管。
21
考染与银染的比较
12%
SDSPAGE
PH 3-10 NL 18cm
97,000 66,000 43,000 31,000
20,100
12%
SDSPAGE
考染 1.5 mg
14,400
PH 3-10 NL 18cm
97,000 66,000 43,000
数千种蛋白质。1980s，固相化pH梯度凝胶，改善了2-D的 重复性，增大了上样量。
生物质谱技术（80年代后期的出现），精确测定生物 大分子相对质量及多肽序列。
计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
5
除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术： ➢ 定量蛋白质组学中应用的同位素编码亲和序列标签技术 (isotope-coded affinity tags, ICAT)和双色荧光技术； ➢ 用于蛋白质间相互作用研究的酵母双杂交技术 (Yeast two-hybrid system) 和蛋白质复合物 (protein complex) 免疫 分离技术 （免疫共沉淀，coimmunoprecipitation, CoIP）； ➢ 用于大规模蛋白质分离与鉴定的多维色谱与质谱联用技 术。
亲/疏水性 酸碱性、分子量分布范围广等
提取困难 分离困难
10
一、双向凝胶电泳（二维凝胶电泳） 是目前能将数千种蛋白质分子同时分离与展示的唯
一的分离技术 （色谱技术不能同时展示在一张图上）。 O’ Farrel 和 Klose 在1975分别建立。
11
基本原理： 第一向—— 等点聚焦电泳
80年代，IPG (immobilized pH gradient)，重复性增高
细胞数
1.2 × 105 1.2 × 107 1.2 × 109
考染 蛋白的量
mg
细胞数
0.2 20.07 2007
1.2 × 108 1.2 × 1010 1.2 × 1012
检出限：银染—1 ng；考染—100 ng； 6 × 107 —1mg 可溶酵母蛋白；MW按50kD
但凝胶电泳，即使是2-DE分离胶上样量也只能为毫克 以下，制备胶的上样可达几个毫克。
12
➢ 第二向—— SDS-聚丙烯酰胺经胶电泳 SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis ) 据相对分子量大小 分离
Edman降解微量测序技术，特别是质谱技术促进了 2-DE的应用
13
MW—第二向
pI—第一向
已成为高通量扫描技术 无法研究 5个数量级
蛋白质
无法扩增 特异性较差（染色、抗体） 差 差
设备昂贵
条件摸索，熟练的技术人员
达不到工业要求的高通量 研究内容
7-12个数量级
3
上述的研究对象——蛋白质组的特点决定了蛋白质组 要采取相应的技术手段，才能进行有效地研究。
4
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），O’ Farrel 在1975建立，可以分离
第二章 蛋白质组研究方法
1
§1 概述
➢ 就一种生物而言，其蛋白质的数目远大于基因数目（人 约有20,000-25,000个基因，50,000-60,000种蛋白）（拼接、 酶原活化和翻译后修饰所致）；
➢ 对于一种细胞/组织而言，基因是静态的，蛋白质是动态 变化的；由于表达调控，蛋白质丰度并不与基因拷贝数成 正比；
31,000
银染 0.3 mg
20,100 14,400
22
➢ 在等点聚焦时，使用 pH 范围较窄的胶条 窄范围IPG胶条，如2—3个pH，甚至一个pH，能
使得质谱可用于用于生物大分 子分析。此前，2-3个蛋白/年；现在 几百个/周。
8
样品（细胞、组织、体液） 图像分析、数据处理 2-DE
电转至膜上
ESI/MS/MS
胶上原位酶切
肽段混合物
PSD/MALDI/ TOF/MS
MALDI/TOF/MS 肽质量指纹图谱
Edman降解 氨基酸分析
➢ 技术角度，DNA可通过PCR体外扩增，蛋白不能，DNA 能高速准确测序，基因芯片非常成熟。
2
DNA 分析 (microarry) 与蛋白质分析方法(2-D & MS) 比较
灵敏度 方法 分子稳定性 重复性 消耗
专业化
自动化程度 修饰情况 动态范围
DNA
30 copy/sample (PCR) 高度特异（序列互补） 好 好 初期投入大 （chip、扫描仪， confocal)，但获得的数据多 成熟，标准化
N端序列
氨基酸组成
肽序列标签
数据库检索 蛋白质鉴定
库中不存在的蛋白质，可检索基 因组数据库（基因序列、EST转 成蛋白序列或反之）
寡核苷酸合成
蛋白实验
免疫组化
基因
蛋白活力（功能）
蛋白定位
蛋白质组数据库
多肽合成
抗体
9
§2 大规模的蛋白质提取、分离技术 蛋白质组提取、分离面对的困难： 样品中蛋白种类数目巨大；特性复杂。
14
1、 低丰度蛋白与膜蛋白的检测与分离技术
大部分蛋白质为低丰度蛋白质，但承担许多重要的生 物学功能比如：调控、信号转导等；
酵母基因组和蛋白质组研究结果表明，密码子偏性系 数（code bias index, CBI）小于0.2的蛋白为低丰度蛋白， 在酵母的6000余个蛋白中占一半；
（不同物种、不同生物体的密码子使用有着很大差异； 在不同物种中，类型相同的基因具有相近的同义密码子使 用偏性。）
6
➢ 用于翻译后修饰（磷酸化，糖基化等）蛋白质图谱展示 与检测的技术； ➢ 蛋白质芯片技术等。
7
质谱学领域的诺贝尔奖
1906年：物理奖 J. I. Thomson 磁质谱仪的基础同位素分析
1989年：物理奖 W. Paul 离子阱技术的发明；
2002年 ：化学奖 J. B. Fenn 电喷雾（ESI）电离方法 Koichi Tanaka 基质辅助激光解吸电离质
15
传统的2-DE很难检出低丰度蛋白 应对措施 ➢ 加大上样量 增大上样量的局限性：
高丰度蛋白的遮蔽作用； 负载量限制无限上样； 实验材料用量太大。
16
2-DE 上样量过大
17
蛋白质检出限于染色方法、起始加样量的关系
蛋白丰度 copy/cell
100000 1000 10
银染 蛋白的量
mg
0.002 0.201 20.07
18
19
成肌细胞 C2C12
20
Hale Waihona Puke Baidu C2C12分化108小时后，形成的肌管。
21
考染与银染的比较
12%
SDSPAGE
PH 3-10 NL 18cm
97,000 66,000 43,000 31,000
20,100
12%
SDSPAGE
考染 1.5 mg
14,400
PH 3-10 NL 18cm
97,000 66,000 43,000
数千种蛋白质。1980s，固相化pH梯度凝胶，改善了2-D的 重复性，增大了上样量。
生物质谱技术（80年代后期的出现），精确测定生物 大分子相对质量及多肽序列。
计算机为基础的图像分析及相应数据库构建。
5
除上述基本的蛋白质组研究技术外，新技术： ➢ 定量蛋白质组学中应用的同位素编码亲和序列标签技术 (isotope-coded affinity tags, ICAT)和双色荧光技术； ➢ 用于蛋白质间相互作用研究的酵母双杂交技术 (Yeast two-hybrid system) 和蛋白质复合物 (protein complex) 免疫 分离技术 （免疫共沉淀，coimmunoprecipitation, CoIP）； ➢ 用于大规模蛋白质分离与鉴定的多维色谱与质谱联用技 术。
亲/疏水性 酸碱性、分子量分布范围广等
提取困难 分离困难
10
一、双向凝胶电泳（二维凝胶电泳） 是目前能将数千种蛋白质分子同时分离与展示的唯
一的分离技术 （色谱技术不能同时展示在一张图上）。 O’ Farrel 和 Klose 在1975分别建立。
11
基本原理： 第一向—— 等点聚焦电泳
80年代，IPG (immobilized pH gradient)，重复性增高
细胞数
1.2 × 105 1.2 × 107 1.2 × 109
考染 蛋白的量
mg
细胞数
0.2 20.07 2007
1.2 × 108 1.2 × 1010 1.2 × 1012
检出限：银染—1 ng；考染—100 ng； 6 × 107 —1mg 可溶酵母蛋白；MW按50kD
但凝胶电泳，即使是2-DE分离胶上样量也只能为毫克 以下，制备胶的上样可达几个毫克。
12
➢ 第二向—— SDS-聚丙烯酰胺经胶电泳 SDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis ) 据相对分子量大小 分离
Edman降解微量测序技术，特别是质谱技术促进了 2-DE的应用
13
MW—第二向
pI—第一向
已成为高通量扫描技术 无法研究 5个数量级
蛋白质
无法扩增 特异性较差（染色、抗体） 差 差
设备昂贵
条件摸索，熟练的技术人员
达不到工业要求的高通量 研究内容
7-12个数量级
3
上述的研究对象——蛋白质组的特点决定了蛋白质组 要采取相应的技术手段，才能进行有效地研究。
4
蛋白质组的技术基础 （三大支撑技术）： 双向电泳（2-DE），O’ Farrel 在1975建立，可以分离
第二章 蛋白质组研究方法
1
§1 概述
➢ 就一种生物而言，其蛋白质的数目远大于基因数目（人 约有20,000-25,000个基因，50,000-60,000种蛋白）（拼接、 酶原活化和翻译后修饰所致）；
➢ 对于一种细胞/组织而言，基因是静态的，蛋白质是动态 变化的；由于表达调控，蛋白质丰度并不与基因拷贝数成 正比；
31,000
银染 0.3 mg
20,100 14,400
22
➢ 在等点聚焦时，使用 pH 范围较窄的胶条 窄范围IPG胶条，如2—3个pH，甚至一个pH，能