分离提纯微生物的两种方法

例谈微生物的培养与分离实验

中学生物学实验的基本技能主要是显微镜的操作、临时装片的制作和微生物培养的基本技术等，其中显微镜的操作、临时装片的制作是初中生物学教学的要求，而微生物培养的基本技术则是高中生物学教学的基本任务。高三生物（选修）教材共四个学生实验，其中两个是关于微生物培养的基本技术和微生物的分离提纯，可见微生物培养的基本技术在高中教学中的地位，在高考命题以能力立意、重视实验考查的今天，使学生掌握微生物培养的基本技术，更有特别的意义。为此，笔者在实验教学实践中结合选修教材实验二、实验三和高校微生物学教程，编写两道微生物实验习题，旨在使学生掌握微生物培养的基本技术，学会微生物分离的一般方法，并对两例作简要分析，供大家参考。

例一：下面两段材料介绍了两种筛选微生物的方法：

方法一：19世纪后期，Robert koch创造了用琼脂制作固体培养基，成功地将混杂地生活在一起的微生物进行了分离和提纯。他先将微生物样品稀释，用接种针沾少许稀释菌液在固体培养基上划线接种，恒温培养后从培养基表面挑选相同特征的某一种菌落，经过几次相同的培养过程，便可将其分离、提纯。

请你模仿方法一，将表层土壤中的圆褐固氮菌与其它杂菌分离，并提纯出其中某一种圆褐固氮菌。

你选择的实验材料和用具有：已消毒的培养皿若干、接种针一支、酒精灯、无菌水、表层土壤样品，还有①；

你实验的操作步骤是：

（一）分离圆褐固氮菌：

（1）样品的稀释：②；

（2）③。

（二）提纯某一种圆褐固氮菌：

（1）样品的稀释：④；

（2）⑤。

方法二：20世纪中期，J.lederberg夫妇创造了影印平板培养法用于筛选具有抗性的微生物。他们用灭菌后的丝绒布包裹在小的木质圆柱体外（外形似印章），让末端均匀沾满待筛选的菌种，然后将“印章”先后影印在普通培养基和选择培养基上，影印时保持印章的相对位置严格的对应性。经恒温培养后，通过对照培养基上生长的菌落，就可获得某种抗性的微生物。

请你模仿方法二，用含四环素的选择培养基将不具抗四环素抗性的大肠杆菌筛选出来。

你选择的实验材料和用具有：已灭菌的“印章”、已消毒的培养皿若干、标签纸、含四环素的选择培养基、大肠杆菌母液，还有⑥；

你实验的操作步骤是：

（一）用“印章”影印接种后培养：⑦；

（二）⑧。

[能力要求]培养学生创造能力是素质教育首要任务，而模仿是创造的开端。此题旨在考查学生阅读分析、理解处理材料的能力；同时在对前人科研模仿的基础上，应用试题给予的知识解决新问题的创造能力。

[解题指导]在第1小题中，要分析Robert koch分离和提纯某种微生物的方法：他先将微生物样品稀释，用接种针沾少许稀释菌液在固体培养基上划线接种，恒温培养后从培养基表面挑选相同特征的某一种菌落，经过几次相同的培养过程，便可将其分离、提纯。然后根据圆褐固氮菌能自生固氮的特点，配制无氮培养基，先将其与其它不能固氮的微生物分离；再从中挑选相同特征的某一种菌落进行培养，以达到提纯某一种圆褐固氮菌的目的。

在第2小题中，要理解J.lederberg夫妇创造了影印平板培养法是一种间接筛选具有某特征的微生物的方法。他们用“印章”先后影印在普通培养基和选择培养基上，影印时保持印章的相对位置严格对应，通过对照两种培养基上生长的菌落，就可获得实验需要的微生物。然后根据不具有抗性的大肠杆菌在普通培养基能够生长，而在选择培养基不能生长的特点，便能筛选出不具有抗性的大肠杆菌。试题的难点是间接筛选，而不是直接选择出具有抗性的大肠杆菌。

[参考答案] ①灭菌后的无氮固体培养基②将表层土壤样品加无菌水稀释，备用③接种后恒温培养：将接种针在酒精灯的外焰上灼烧，冷却后沾少许表层土壤样品稀释液，在火焰旁于灭菌后的无氮固体培养基上划线接种，置于250C恒温箱中培养一周。在培养基表面生长的菌落便是能自生固氮的圆褐固氮菌④用接种针从生长的菌落中挑选相同特征作为再次提纯的样品，加无菌水稀释备用⑤接种后恒温培养：方法同③，经几次相同的培养过程，便可将其分离、提纯得到某一种圆褐固氮菌。⑥普通固体培养基⑦用“印章”沾大肠杆菌母液先后影印在普通培养基和选择培养基上，影印时保持印章的相对位置严格对应，影印后置于250C恒温箱中培养一周⑧筛选后取样接种：用接种针挑选在普通培养基上能够生长而在选择培养基对应位置上不能生长的菌落，配成母

液再按上述方法影印接种，便可得到不具抗性的大肠杆菌。

例二：为了研究细菌对青霉素抗药性形成的机理，有人设计了如下实验方案：

（一）取培养皿A若干(A1、A2、A3……)，加入普通培养基；取培养皿B若干(B1、B2、B3……)，加入含青霉素的培养基；

（二）将适量细菌培养液涂抹在培养皿A1的培养基表面，放在适宜的温度下培养一段时间，培养基的表面长出些细菌菌落；

（三）用灭菌后的丝绒包上棉花制成的一枚“印章”，在A1上轻轻盖一下，保持“印章”位置不变，再在B1上轻轻盖一下，将B1培养一段时间后，B1上一定部位出现了少量菌落；

（四）根据B1中菌落出现的方位，将A1中对应位置的菌落取出，均匀涂抹在A2的表面，培养一段时间后，培养基表面又会出现许多菌落；

反复重复步骤三、四，在B2、B3……中保留下来的菌落越来越多。直到最后 B上生长的菌落全部都具有对青霉素的抗性。分析后回答：

⑴细菌对青霉素抗性的产生是由于细菌①的原因。青霉素在细菌抗药性形成的过程中起②作用。

⑵如果B1中没有长出菌落，你将采取③方法对实验菌种进行改造？

⑶实验设计：设计实验选择能作运载体质粒，并确定质粒基因抗性的类别。

①实验原理：有标记基因如具有抗菌素抗性基因的质粒，才能作为运载体。具有抗性的细菌能在相应的选择培养基上生长。

②材料用具：10万单位的青霉素溶液、10万单位四环素溶液、菌种试管、盛有无菌培养基的培养皿、酒精灯、接种环、一次性注射器若干、蒸馏水、恒温箱等。

③方法步骤：

第一步：取三个盛有无菌培养基的培养皿并标为1、2、3号；在酒精灯旁，用三支注射器分别注入1mL蒸馏水、青霉素液、四环素液，并使之均布在三个培养基表面；

第二步：④；

第三步：⑤；

④预期结果：A、⑥； B、⑦；

C、⑧；

D、⑨。

[能力要求]生物学是一门实验科学，生物高考题中实验占有一定的比例。本题侧重于考查学生对实验过程的观察与理解、对实验现象的解释和分析以及对实验可能性的预测能力；同时本题也考查了学生的阅读理解和文字表达能力。

[解题指导]本题在分析细菌对青霉素抗药性形成的机理时，要抓住培养皿A

若干(A

1、A

2

、A

3

……)中加入的是普通培养基，而培养皿B若干(B

1

、B

2

、B

3

……)，

加入含青霉素的培养基。培养皿B在实验中的作用是通过对比指出培养皿A中具有抗性的菌落的位置。培养皿A中有抗性的菌落在实验过程中始终没有与青霉素接触，从而证实抗性的产生是细菌繁殖中基因突变的结果。

在实验设计中要正确认识选择培养基的作用，质粒上有青霉素抗性基因的细菌才能在含青霉素的培养基上生长，质粒上有抗四环素基因的细菌才能在含四环素的培养基上生长，在两类培养基上都不能生长的则质粒上没有抗性基因，这类质粒不能作运载体，把握住这些解题关键，便能对实验结果的做出恰当的预测。

[参考答案] ①繁殖过程中的基因突变②选择③用理化方法诱发细菌基因突变④将接种环灼烧待冷却后，取菌种在酒精灯火焰旁分别为1、2、3号培养皿接种⑤恒温培养一段时间后，观察三具培养皿上菌落的生长和分布情况⑥只有1号培养皿上长有菌落，说明细菌的质粒上没有抗性基因⑦1、2、3号培养皿上都有菌落，说明质粒上既有青霉素抗性基因，又有抗四环素基因⑧只在1、2号培养皿上长有菌落，说明质粒上有青霉素抗性基因，无抗四环素基因⑨只在1、3号培养皿上长有菌落，说明质粒上无青霉素抗性基因，有抗四环素基因。