抗真菌药物敏感试验

试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
¡ 药液的制备
储存液：浓度至少为1280μg/mL或10倍于受试的最高浓度。储存 液浓度需根据药物本身溶解性决定。
氟康唑和5－氟胞嘧啶（5－FC）以灭菌蒸馏水溶解；酮康唑、伊 曲康唑、两性霉素B、伏力康唑等采用DMSO溶解。
储存液分装后置－60 ℃保存。解冻后的储存液应在24h内使用，不 得重复冻存使用。
细菌不同，因此抗真菌药物敏感试验一直是国内外学者研究的难题。因 此，实验方法多样化，但尚无通用的标准方法。 ¡ 美国国家临床试验标准委员会（NCCLS）从1992年起，制订了一系列针 对抗真菌药物敏感实验的指导性文件，但目前仍不能适用于所有医学真 菌的检测。
抗真菌药敏试验目的
¡ 指导抗真菌药物的选择 ¡ 测定抗真菌药物对致病真菌的敏感性，提供临床用
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
结果的判定
¡ 新三唑类药物 酵母菌的MIC值为0.03~16 μg/mLLeabharlann Baidu大多数酵母菌的MIC值小于1
μg/mL。目前尚无资料说明MIC值与临床疗效之间的关系。 ¡ 氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑
判定标准如下表所示。氟康唑的判定标准不适用于克柔念珠菌。 采用不适当的溶媒溶解伊曲康唑可导致结果偏差。
概述
¡ 真菌感染的发病率,尤其是深部真菌感染的发病率逐 渐增高
¡ 大量新型抗真菌药物不断涌现 ¡ 临床耐药菌株的出现
抗真菌药物敏感实验为临床耐药菌株的发现， 抗真菌药物的选择提供指导。
概述
¡ 抗真菌药物敏感实验方法是建立在抗细菌药物敏感实验方法基础之上 ¡ 由于真菌是一种高等的生物，其繁殖方式、生长周期、生长条件等均与
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
¡ 药液的制备
使用液： 水溶性药物以无菌蒸馏水将储存液倍比稀释 至工作液浓度（10倍测试浓度）。
非水溶性药物则需将储存液用DMSO倍比稀释至100倍测 试浓度，再采用无菌蒸馏水稀释至工作液浓度（10倍测试浓 度），以防止药物的析出。
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
药量及预后监测的参考 ¡ 筛选耐药菌株及研制对致病真菌有效的抗真菌药物
提供临床应用
常见术语
¡ 最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC） MIC50，MIC90，MIC50％～80％
¡ 最低杀菌浓度（minimal fungicidal concentration MFC） MFC50，MFC90
注意事项
¡ 测试药物的浓度范围应包括终点浓度和质控株的MIC范围。一般常见药 物的测试浓度范围：
两性霉素B 0.0313~16μg/mL； 氟胞嘧啶0.125~64 μg/mL ；
酮康唑0.0313~16 μg/mL；
伊曲康唑0.0313~16 μg/mL；
氟康唑0.125~64 μg/mL，
新三唑类药物（如伏力康唑等）0.0313~16 μg/mL。
念珠菌体外药物敏感试验的结果判定标准
氟康唑
敏感 （S）
≤8
剂量依赖敏感 （S－DD）
16~32
中度敏感 （I）
耐药 （R）
≥64
伊曲康唑 ≤0.125
0.25~0.5
≥1
氟胞嘧啶
≤4
8~16
≥ 32
注：如果测定的MIC值位于上述分类之间，则将该菌划分入 高一级类别中
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
验，进行质量控制。 ¡ 将试管置于35 ℃培养46～50h观察结果。对于新生隐球菌，培养时
间应延长至70～74h。
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
结果判读
¡ 两性霉素B 终点的判断比较容易，无肉眼可见生长的最低药物浓度为两性霉素B
的MIC值。 ¡ 氟胞嘧啶及唑类
往往在最低浓度时也可出现轻度浑浊。此时，可取生长对照管中菌 悬液0.2mL，加入培养基0.8mL混匀作为判断终点的浊度（即80％菌的生 长受到抑制时的浊度)，与此浊度相近的试管即可判定为终点，其药物浓 度为该药的MIC值。
受试菌在SDA或PDA中35℃ 培养24小时（念珠菌属）或48小时 （新生隐球菌）。
取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒， 采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于 1×106～5×106/mL，作为菌液的贮备液。
使用时，采用2倍量培养基将菌液调整至工作浓度为1.0×103～ 5.0×103/mL。再用无菌蒸馏水倍比稀释成0.5×103～2. 5×103/mL。
¡ 最低有效浓度（minimal effective concentration，MEC ）
抗真菌药敏试验方法
¡ 药基法
琼脂稀释法 试管（液体）稀释法 微量液体稀释法
¡ 菌基法（琼脂扩散法）
ROSCO抗真菌药敏纸片法 E试验法（E－test）
酵母样真菌药物敏感试验
¡ 酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验于1992年由美国国家 临床试验标准化委员会（NCCLS）提出标准实验方案（M27 －P）以来，几经修订，目前已由M27－A2取代。此外，其 他药物敏感试验方法如琼脂稀释法，琼脂扩散法，E试验法 等时有应用。
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
注意事项
¡ 测试过程中，需进行生长空白对照、空白对照、质控菌株对照。 ¡ 应选择对抗真菌药物无拮抗作用的缓冲液溶解RPMI 1640培养基，如
MOPS。Tris缓冲液、PBS缓冲液因可与药物存在相互作用而不适用。 ¡ 培养基pH值可能影响测试结果，应严格控制pH值于6.9~7.1。
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
实验步骤：
¡ 取无菌的15mm×100mm试管进行实验 ¡ 在试管中依次加入0.1mL倍比稀释的不同浓度药物工作液。 ¡ 依次在试管中加入0.9mL菌工作液，混匀。注意整个过程需在
15min内完成。 ¡ 实验过程中，设置空白对照和生长对照。同时进行质控菌株平行试
¡ 培养基的制备
2倍浓度RPMI 1640培养基（不含NaHCO3） 作为标准培养基，用0.33mol/L MOPS缓冲液溶解,调 节pH值至6.9~7.1（室温），过滤除菌，4℃可保存4 周。在培养基中加入4%葡萄糖可促进菌生长，帮助 终点的判断。
试管液基稀释法 (NCCLS-M27A)
¡ 菌液的制备