抗菌药物敏感性试验(药敏试验)
抗菌药物敏感试验
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
22
操作方法：
1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
23
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻 轻挤压以挤去过多的菌液。棉签在三个方向平均涂抹 琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀分布，最后沿平 板内缘涂抹一周。
24
4.用镊子将E-TEST试条的抗菌药物的一面贴向琼脂表 面，有刻度的一面向外，直径140mm的平板可放置 6条，90mm平板只能放置1～2试条 。
5.孵育，置平板于35℃孵育16～24h。
25
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交 处的刻度即为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
No
No
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第九节 细菌的分类命名
一、分类原则:细菌的分类原则上分为传统 分类和种系分类。
分类方法： （1）人为分类法：
11
嗜麦芽窄食单胞菌：甲氧苄啶/磺胺异噁唑、左氧氟沙 星、米诺环素 ；
嗜血杆菌属：氨苄西林、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、头孢 他啶、美罗培南、阿奇霉素、环丙沙星、头孢克洛；
淋病奈瑟菌：头孢曲松、环丙沙星、青霉素、大观霉素、 四环素 ；
肺炎链球菌：红霉素 、苯唑西林 、甲氧苄啶/磺胺异噁唑、 克林霉素、左氧氟沙星、四环素、万古霉素 ；
细菌耐药性原理-抗菌药物敏感试验kej
但价格较高。
操作方法： 1.挑取16～20h的菌落 2.用无菌生理盐水制备成0.5麦氏比浊管浊度的菌液。
3.用无菌棉签浸入细菌悬液中，将拭子在试管上壁轻轻挤压以挤去过多 的菌液。棉签在三个方向平均涂抹琼脂表面（每次转60℃）使菌液均匀 分布，最后沿平板内缘涂抹一周。
联合药敏试验的方法
• 棋盘稀释法
• 原理 先测定两药单药时各自的MIC值，再将各种稀释度的两药混合， 测定两药联合时各药的MIC值，比较两药联合时MIC值与其单独MIC 值，计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concectration，FIC)， 作为协同、相加、无关和拮抗的判断。
大肠埃希菌 头孢噻肟
浓度 0.5
1
2
4 ug/ml
3.抗菌药物敏感性试验的方法
浓度梯度法（E-Test）药敏试验
E-Test即浓度梯度（多点药物浓度法）琼脂扩散试验。E试纸条背面含 有干化、浓度由高至低连续梯度分布的抗菌药，药物浓度按log2梯度递 减。抗菌药物从具有浓度刻度的塑料试纸条中向琼脂中扩散，在试纸条 周围抑菌浓度范围内受试菌的生长被抑制，从而形成透明的抑菌圈，抑 菌圈与试纸条的横向相交处的读数刻度为MIC值。
抗菌药物的临床实践
剂量 方案
血药浓度/时间
药代动力学 PK
其他组织或体液药 物浓度/时间
感染部位药物 浓度/时间
药理学或 毒副作用
抗菌作用/ 时间
药效动力学 PD
＋ PK：反应体内药物浓度 变化与时间关系
PD：反应抗菌药物在体 外抗菌活性变化过程
MIC MBC PAE MPC
四抗菌药物敏感性试验
四、抗菌药物敏感性试验（一）药敏试验的目的测定病原微生物对化学治疗药物敏感性的试验称为化疗药物敏感性试验（Drug sensitivity test），简称药敏试验。
药敏试验的主要目的是：①用于测定新的抗菌药物或制剂的抗菌谱；②对病灶分离菌进行流行病学调查，主要应用于测定细菌经过多年后敏感性的变化情况和地区特异性；③在临床治疗感染性疾病时，针对病原菌选择合适的首选药物品种。
（二）药敏试验的原理及种类药敏试验是通过培养基培养的细菌确定细菌对药物的敏感性方法。
将被检菌接种在适当的培养基上，然后加上不同种类或不同浓度的抗菌药物（或制剂），观察细菌生长发育的速度和程度。
用药后，细菌在培养基上停止生长并且死亡，抑菌圈清晰，说明细菌对药物敏感，药物表现有较强的杀菌作用；用药后，细菌停止生长，但液体培养基经过一定时间后还可能出现浑浊或固体培养基上的抑菌圈不清晰，说明细菌对药物比较敏感，预示药物对被检细菌只是起抑菌作用。
通常判定一种药物对细菌的杀菌或抑菌作用的强度指标是固体培养基中抑菌圈的大小，但这也不是绝对的，因为抑菌圈的大小与药物对培养基的渗透性是密切相关的。
药敏试验方法较多，但在原理上不外乎是稀释法和扩散法两大类。
而扩散法（包括纸片法、管碟法）通常适用于临床治疗选择药物。
（三）常用培养基制作法1．普通肉汤培养基牛肉浸膏 3.0克蛋白胨 10.0克氯化钠 5.0克蒸馏水 1000毫升放在三角烧瓶中，微温溶解后，调节pH值至7.4~7.6，煮沸10分钟，冷却后的pH值为7.2±0.2。
15磅压力下灭菌15分钟（115℃灭菌30分钟）即得。
本培养基可用作为固体、鉴别、选择等培养基制造的基础原料，大部分细菌都能在其中生长。
1．普通肉汤琼脂培养基照上述普通肉汤培养基的配方及制法，加入15~20克琼脂，加热溶解后，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
3．0.5%葡萄糖肉汤培养基蛋白胨 10克氯化钠 5克葡萄糖 5克牛肉浸膏 3克蒸馏水 1000毫升微温溶解后，调节pH值至弱碱性，煮沸后，加葡萄糖溶解，摇匀，滤清，调节pH值使灭菌后为7.2±0.2，分装，115℃灭菌30分钟，即得。
第4章抗菌药物敏感试验
第4章抗菌药物敏感试验一、需氧菌和兼性厌氧菌的体外抗菌药物敏感试验1.扩散法（K-B法）（1）原理将含有定量抗菌药物的纸片贴在接种有待检菌的琼脂平板上，该点称为抗菌药源。
药物向周围扩散，形成了随着药源距离增加，琼脂中药物浓度递减的浓度梯度。
在药源周围可抑菌浓度范围内待检菌的生长被抑制，形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，其大小可以反映待检菌对测定药物的敏感性，并与该药对待检菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈愈大，MIC愈小。
（2）实验材料①培养基：采用水解酪蛋白（M-H）琼脂，pH为7.2，琼脂厚度4mm。
对生长条件要求高的细菌，如链球菌属细菌需加入5%脱纤维羊血，嗜血杆菌属细菌需加入1%血红蛋白（含Ⅴ因子）和1%Ⅹ因子复合物。
②抗菌药物纸片：选用直径为6.35mm，吸水量20μl的专用药敏纸片。
制备时取灭菌药敏纸片，经加样或浸泡药物溶液后冷冻干燥，置4℃保存备用，在有效期内使用。
③接种菌液挑取平板上形态相同的菌落4～5个，接种于3～5ml M-H肉汤中，于35℃中培养2～8h。
嗜血杆菌属和链球菌属细菌需用加血肉汤培养过夜。
用生理盐水或肉汤校正菌液至0.5麦氏比浊标准（相当于1.5×109/ml的含菌量）后在15min内接种。
（3）试验方法以无菌棉拭蘸取已制备好的菌液（其浊度为0.5麦氏比浊标准），在M-H琼脂表面均匀涂布接种3次，每次平板旋转60°，最后沿平板内缘涂抹１周。
平板置室温干燥3～5min，后用无菌镊子或专用纸片分配器将含药纸片贴于琼脂表面。
纸片应贴得均匀，各纸片中心相距＞24mm，纸片距平板内缘＞15mm。
直径为90mm的平板可贴6张纸片。
纸片贴牢后应避免再移动。
平板室温放置15min后倒置于35℃培养箱中培养16～18h后读取结果。
（4）结果解释平板置黑色背景上，从背面量取包括纸片直径在内的抑菌圈直径，单位为mm。
培养基中如果加有血液须打开皿盖从正面测量抑圈菌。
医院抗菌药物敏感性试验的技术要求(2022年版)
(2022年版)1范围 (2)2 术语和定义 (2)3 常规药敏试验的药物选择和报告 (4)4 药敏试验方法 (7)5 各种属细菌药敏试验 (12)6 质量控制(Quality control, QC) (17)7 商品化药敏试验检测系统的性能验证 (19)附录 A (资料性附录) 临床各种属细菌的药敏试验方法和试验条件 (23)附录 B (资料性附录) 不常见苛养菌和非苛养菌药敏试验折点 (27)1 范围本标准规定了临床抗菌药物敏感性试验的技术要求，包括常规药敏试验的药物选择和报告、药敏试验方法、各种属细菌药敏试验、常见菌特殊耐药表型检测、药敏试验的质量控制、商品化药敏试验检测系统的性能验证。
本标准合用于开展临床微生物学检验的各级临床实验室。
2 术语和定义下列术语和定义合用于本文件。
2.1抗微生物药物敏感性试验 Antimicrobial susceptibility testing指检测微生物(本行业标准特指细菌)对抗微生物药物(本行业标准特指抗菌药物)的体外敏感性，以指导临床合理选用药物的微生物学试验，简称药敏试验。
2.2最低抑菌浓度 Minimal inhibitory concentration；MIC指在琼脂或者肉汤稀释法药物敏感性检测试验中能抑制肉眼可见的微生物生长的最低抗菌药物浓度。
2.3折点 Breakpoint能预测临床治疗效果，用以判断敏感、中介、剂量依赖型敏感、耐药、非敏感的最低抑菌浓度(MIC)或者抑菌圈直径(mm)的数值。
2.3.1敏感 Susceptible；S当抗菌药物对分离株的MIC值或者抑菌圈直径处于敏感范围时，使用推荐剂量进行治疗，该药在感染部位通常达到的浓度可抑制被测菌的生长，临床治疗可能有效。
2.3.2中介 Intermediate； I当菌株的MIC值或者抑菌圈直径处于中介时，该数值接近药物在血液和组织中达到的浓度，从而治疗反应率低于敏感菌群。
该分类意味着采用高于常规剂量治疗时或者在药物生理浓集的部位，临床治疗可能有效。
抗菌药物敏感试验
操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解
2.抗菌药物母液的稀释
3.在微量聚乙烯微板孔中加各种不同浓度的抗生素 100μl，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管。
4.挑选18~24小时的菌落置M-H肉汤增菌4~6小时。
5.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。
除肺炎链球菌外的其他链球菌：红霉素、青霉素、克 林霉素、万古霉素、头孢曲松、左氧氟沙星。
7.用无菌镊子或纸片分配器将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂 的表面，一旦纸片贴上，不能移动；各抗菌纸片中 心距离应大于24mm，纸片距平板内缘应大于15mm。
8.经过35℃16～24h孵育。
9.取抑菌环直径，根据 CLSI（clinical and laboratory standards institute ）标准，报 告细菌对该抗生素 敏感(susceptible,S)、 耐药(resistant,R)、 中介(intermediate,I)。
纸片扩散法（KirbyBauer法）
原理：
将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼 脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散形成递减 的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试 菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈 即为抑菌圈。
抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏 感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关。
第四章 抗菌药物的敏感性试验
药敏试验的意义
1、可预测抗菌治疗的效果 2、指导临床抗菌药物的使用 3、发现或提示细菌耐药机制，帮助临床医生合理使 用抗菌药物 4、监测细菌的耐用性，分析耐药菌的变化，预防和 控制耐药菌感染的发生和流行
抗菌药物的敏感性试验
常用方法：
抗菌药物敏感性试验执行标准
抗菌药物敏感性试验执行标准抗菌药物敏感性试验是临床微生物学中非常重要的一项实验，它可以帮助医生选择最有效的抗菌药物来治疗感染性疾病。
执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
下面将介绍抗菌药物敏感性试验执行标准的相关内容。
首先，进行抗菌药物敏感性试验前，需要准备好所需的培养基、试验材料和各种试剂。
同时，要做好实验室的消毒和无菌操作，以确保试验的准确性和可靠性。
在进行试验时，需要按照严格的操作规程进行。
首先，要准备好待测菌株的悬浮液，然后按照一定比例将其接种到含有不同浓度抗菌药物的琼脂平板上。
接种后，要在恒温培养箱中进行培养，培养时间一般为16-18小时。
培养结束后，需要观察菌落的生长情况，并进行相关的数据记录和分析。
根据菌落的生长情况和抗菌药物的浓度，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性。
在记录和分析数据时，要注意细致入微，确保数据的准确性和可靠性。
在执行标准中，对试验结果的解释和判定也非常重要。
根据试验结果，可以判断出菌株对抗菌药物的敏感性、耐药性或者中间敏感性。
这些判定对于临床治疗具有指导意义，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
此外，在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除。
比如，培养条件、试剂质量、操作技术等都可能对试验结果产生影响，需要在试验过程中进行严格的控制和调节。
总的来说，抗菌药物敏感性试验执行标准的严格性和准确性对于试验结果的可靠性至关重要。
在实验过程中，需要严格按照操作规程进行，确保试验过程的准确性和可靠性。
同时，对试验结果的解释和判定也非常重要，可以帮助医生选择最合适的抗菌药物来治疗感染性疾病。
在执行标准中，还需要对试验过程中可能出现的干扰因素进行控制和排除，以确保试验结果的准确性和可靠性。
抗菌药物的敏感性试验及报告解读
明确提出在二级以上医院设立感染科与感染临床药师（第12、
13条），及临床微生物室（第14条）
6
Company name
概况和制定过程
第一章 总则
第六章 附则 第五章 法律责任
共六章 53条
第二章 组织机 构和职责
• 组织医院管理、临床、药学 、微生物检验、感染等方面 专家起草《抗菌药物临床应 用管理办法》
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培养条件（一）
需氧菌： 35℃ ±2 ℃ ，16-18小时 嗜麦芽窄食单胞菌、洋葱伯克霍尔德菌：20-24小时 葡萄球菌：33-35 ℃ ，OXA、MET、NAF、VAN24小时 肠球菌：VAN 24小时 溶血性链球菌、肺炎链球菌、奈瑟氏菌属等：20-24小时
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Company name
操作：
无菌棉签蘸取菌液，在管壁内将多余菌液旋 转挤去后，在琼脂表面均匀涂布接种3次， 每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1 周。 室温干燥或35℃干燥5-15分钟 用纸片分配器或无菌镊子将药物纸片紧贴于 琼脂表面 纸片间距 20mm 纸片离平板内缘 15mm
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Company name
抗生素药敏试验质控
• 4月11日起征求全国意见
• 制定《抗菌药物临床应用分
第三章 抗菌药物 级管理目录》
临床应用管理
• 4月15日期征求全国意见
第四章 监督管理
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Company name
第三章 抗菌药物临床应用管理
• 三级医院 不得超过50种，二级医院 不得超过35种 • 同一通用名称药品的品种，注射剂型和口服剂型各不得超过2种，处方组成
葡萄球菌属 Mueller-Hinton（MH）琼脂
细菌药敏试验概述
3
药物分组
判断折点
标准菌株质控范围
特殊的耐药监测
敏感性分类(CLSI的定义)
敏感（Susceptible）
用常规用量治疗有效 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的
MIC 5倍以上。
耐药（Resistance）
用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度
5.平板置室温干燥3~5分钟，用无菌镊子或纸片分配器 将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不 能移动；各抗菌纸片中距离应大于24mm，纸片距平板 内缘应大于15mm。
6.盖上平板的盖子，置35℃培养箱内孵育16~18小时后 阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育24小 时。
7.用游标卡尺或直尺量取 抑菌环直径，根据CLSI标 准，报告细菌对该抗生素
敏感性分类（2）
中介 (Intermediate)
MIC接近血、体液中药物的浓度，治
疗反应率低于敏感株
药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效
缓冲区：防止操作的系统误差造成重
大结果的判定错误
药敏试验的方法学
半定量…纸片扩散法 (抑菌圈直径)
MIC法：
稀释法(肉汤、琼脂) 自动化仪法 抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪
第四章
抗菌药物敏感试验
黄露萍
抗菌药物敏感试验
测定抗菌药物在体外对病原微生物有无
抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏
感性试验（Antimicrobial Susceptibility
Test），简称药敏试验（AST）。
药敏试验的意义
预测抗菌治疗的效果；
关于抗菌药物敏感性试验(药敏试验)课件
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑 制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。
抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度
抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
稀释法
定量测定抗菌药物活性 抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌
关于抗菌药物敏感性 试验(药敏试验)
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择 最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐 药的微生物流行病学资料
根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测 试细菌的琼脂平板上
纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
按 抑 菌 环 直 径 判 断 细 菌 的 敏 感 性 ， 应 依 据 CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏 感、中介、耐药。
结果判断
在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示
接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和 药敏试验
抗菌药物选择出的高频突变耐药株
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物 的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状 爬行生长可以忽略。
治疗对基本药物过敏的患者
治疗少见菌的感染
流行病学调查为目的向感染控制部门报告
试验方法—纸片扩散法
改良Kirby-Bauer法(K-B法)
试验材料
培养基
非苛氧菌用Mueller- Hinton（M-H）琼
脂
药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl
菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
抗菌药物敏感性试验(药敏试验)
平板孵育规定时间（一般为18-24h）后读 取结果，葡萄球菌和肠球菌必须孵育24h以 检测苯唑西林和万古霉素的耐药性。
孵育16-18h 后检查每一块平板
如果划线满意，接种物准确无误，抑菌圈应 为正圆形，菌落应融合生长
磺胺异恶唑
所有菌属
所有磺胺类
萘啶酸（敏感） 肠杆菌科
头孢噻吩/头孢 肠杆菌科 唑啉（敏感）
所有喹诺酮类敏感 所有头孢菌素敏感
万古霉素 氨苄西林
革兰阳性杆菌 肠球菌属
替考拉宁 青霉素
B组药物
细菌对A组同类药物耐药，可选择性报告 报告指征
特定的标本来源 多种细菌感染 多部位感染 对A组药过敏、耐受或无效 以流行病学调查为目的向感染控制部门报告
用镊子取纸片一张贴在琼脂平板表面，轻 压使其与琼脂完全接触。纸片中心间距 ≥24mm,纸片中心距平皿边缘≥15mm。 直径90mm的平板最好贴6张。
15min内将平板倒置放温箱孵育。
注意
纸片一旦贴下就不可再挪动位置，因纸 片中的药物已扩散到琼脂中。 需要时应在适当的地方贴新纸片
孵育
必须用35℃孵箱（苛氧菌药敏平板应置 于5% CO2 环境）
菌液浓度为1.5×108/ml 质控菌株
金黄色葡萄球菌 ATCC 25923 大肠埃希菌 ATCC 25922 铜绿假单胞菌 ATCC 27853
操作方法
菌液制备
挑取已纯化的4~5个菌落制备菌悬液
生长法
挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的菌 落，用接种环接触每个菌落顶部
转移至4~5mL 适宜的液体培养基中（如 胰酶消化大豆胨肉汤）
置35℃孵育2-6 h 用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
细菌对抗菌药物的敏感试验
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细菌对抗菌药物的敏感试验
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细菌对抗菌药物的敏感试验
l 2、抑制蛋白质的转录或合成
l 由于真核生物和原核生物核糖体的差异， 真核生物的核糖体主要是80 S，由60 S和 40 S两个亚基组成，而原核生物的核糖体 是70 S，主要由30 S和50 S两个亚基组成。
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细菌对抗菌药物的敏感试验
l 2 、靶位的改变
l 由于抗菌药作用的靶位(如核糖体和核蛋 白)发生突变或被细菌产生的某种酶修饰 而使抗菌药物无法发挥作用，以及抗菌药 的作用靶位(如青霉素结合蛋白和DNA回 旋酶)结构发生改变而使之与抗生素的亲 和力下降，这种耐药机制在细菌耐药中普 遍存在。
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细菌对抗菌药物的敏感试验
l 结果观察：含最小药物量仍呈明显不混 浊的一管所含的药物浓度即为该抗菌药 物 对 试 验 菌 株 的 最 小 抑 菌 浓 度 （ MIC ） 。
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细菌对抗菌药物的敏感试验
2、血药浓度（血清中抗菌药 物的浓度）
l 在使用各类抗菌药物时，常常会遇到 的一个重要问题，就是血药浓度。例如： 口服抗菌药物总是经肠道逐渐吸收入血 的。因此，血液中的药物浓度是从无到 有随时间的延长逐渐增高的。即使静脉 注射抗菌药物，因存在着首过效应（第 一关卡效应）和肾脏的排泄作用，血药 浓度也是随着注射的次数而逐渐增高的。
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细菌对抗菌药物的敏感试验
l 三、细菌耐药性产生的机理
l 细菌的耐药性机理主要有生化机理和基因 机理两个方面：
l (一）、生化机理：
l 1、细菌产生破坏药物结构的酶
药敏试验
≤13 14～22 ≥23
≥8
≤0.5
GEN 庆大霉素 10IU
≤12 13～14 ≥15
≥8
≤4
（五）药物敏感试验结果解释
“敏感”（susceptible，S）：表示测试菌可被测 定药物常规剂量给药后在体内达到的血药浓度 所抑制；
“耐药”（resistant，R）：表示测试菌不能被在 体内感染部位可能达到的抗菌药物浓度所抑制， 临床治疗无效。
二、稀释法：琼脂稀释法
将药物混匀于琼脂培养基中，配制含不同 浓度药物平板，使用多头接种器接种细 菌，经孵育后观察细菌生长情况，以抑 制细菌生长的琼脂平板所含药物浓度测 得MIC。
MIC：稀释法所测得的某抗菌药物能抑制 被检菌肉眼可见生长的最低浓度
琼脂稀释法具体实验步骤：
1. 抗菌药物储备液的配制：将各种抗菌药物制备 成琼脂稀释法试验需要的药物浓度。
标卡尺量取抑菌圈直径。 根据NCCLS标准，作出 “敏感”、“耐药”和 “中介”的判断。
几种抗生素抑菌环解释标准及相应的最低抑菌浓度
代号 抗生素
纸片 含药量
抑菌环直径（mm）
耐药
中介
敏感
相应的MIC（μg/ml）
耐药
敏感
P-G 青霉素G 10IU
≤20 2素
15IU
一、纸片扩散法
（一）试验原理 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种 测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药 物吸收琼脂中水分，溶解后不断向纸片周 围扩散形成递减的梯度浓度。在纸片周围 抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制， 从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的 敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负 相关关系，即抑菌圈愈大，MIC值愈小。
抗菌药物敏感性试验
面向外。 5)孵育，置平板于35℃孵育16-24h。
20
6.孵育后形成一椭圆形抑菌圈，抑菌圈和试条的相交处的刻度即 为抗菌药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC) 。
椭圆形细菌生 长抑制区
24
抑菌浓度指数（FICI）
FICI ＝
A药联合时的MIC A药单测的MIC
＋
B药联合时的MIC B药单测的Hale Waihona Puke ICFICI ﹤1为协同作用；
FICI =1为累加作用；
FICI﹥1 为拮抗或无关作用，无关时药物组合的MIC 等于浓度高的药物的MIC。
25
2、抗菌药物的杀菌活性 （1）最低杀菌浓度（MBC）
11
（5）孵育：放于35℃孵箱中，通常于16-18h后，测量抑菌环直径。
12
（6）测量抑菌环直径
13
（7）与解释标准核对得出结论 敏感(susceptible, S)：所分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时在感 染部位可达到的药物浓度所抑制。 耐药 (resistant, R)：所分离菌株不被测试药物常规剂量可达到的药 物浓度所抑制。
时的抗菌效果，其结果可以表现为协同、拮抗、累加和无关。
23
2）部分抑菌浓度指数（FICI）测定： 测定A、B两种药的MIC值，根据MIC值将两药配成不同浓度的
含药肉汤，将各浓度的A药和B药肉汤两两等量混合，组成棋盘模式 不同药物组合的含药肉汤。观察孵育后各行列中不长菌的最低药物 浓度管，即为药物组合的MIC值。
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（2）时间杀菌试验（time-kill assay）
1）概念：是指能够使试验菌减少99.9%以上的最低药物浓度。 2）操作方法：分别取高于MIC值的各管中的菌药混合肉汤划线接种于
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B组 C组
常规和首选药物，其结果应常规报告
首选试验选择性报告。包含一些临床 上重要的、特别针对医院感染的药物 替代性和补充性药物
U组
补充性试验，仅用于治疗泌尿道感染 的抗菌药物。
药物选择
表中小框内是一组类似药物，其结果解释
和临床效力相似，不必个个试验。
“或”字表示一群相关药物，其抗菌谱和
第一、二代头孢菌素和氨基糖甙类药物体外
可能有活性但临床无效故不应报告敏感
沙门菌属的肠道外分离株应测试并报告
氯霉素和一种三代头孢菌素的敏感性
肠球菌对头孢菌素类、氨基糖甙类、磺
胺甲恶唑/甲氧苄啶和克林霉素在体外可
能有活性但临床耐药，不能报告敏感。
MRS 应 报 告 耐 受 所 有 β- 内 酰 胺 类 药 物
稀释法
定量测定抗菌药物活性
抗菌药物与肉汤或琼脂培养基混合稀释后
种入试验细菌，孵育过夜。 以能抑制细菌生长的最低浓度为最低抑菌 浓度（MIC） 将MIC与机体血清或体液中可获得药物浓度 相比较来确定恰当的临床疗效
MIC的对数与抑菌环直径关系 ——近似线性负相关
CLSI药物选择原则
上用接种环挑取单个新鲜菌落，悬浮 于生理盐水或肉汤中震荡混匀
与标准比浊管比浊，以有黑字的白纸
为背景调整其浊度相当于0.5号麦氏管。
平板接种
用无菌棉拭子蘸取菌液
在管壁上方旋转挤压几次去掉过多水分
用拭子涂布整个M-H培养基表面，反复
几次，每次将平板旋转60°
最后沿平皿周边绕两圈以保证涂布均匀
过低、过高会使某些药物失去效力（如氨基
糖甙类和大环内酯类）或活性可能增强（如 青霉素类）。
湿度
若使用前琼脂表面过分潮湿，应放35℃
孵箱或在室温下敞开盖子倒臵，直至多 余水分蒸发。
琼脂表面应保持湿润 在接种后琼脂表面或平板的盖子表面不
应有可见的潮湿水珠
胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶影响
过量胸腺嘧啶核苷或胸腺嘧啶可逆转磺胺
制备好的菌液必须在15min内使用
贴纸片前可将培养皿盖半开3-5min 以使表
面过多水分被吸收但不超过15min
加贴纸片
将接种好的平板敞开盖子倒臵在室温下
干燥3-5min 使平板上的水分被琼脂完全 吸收。
用镊子取纸片一张贴在琼脂平板表面，
轻压使其与琼脂完全接触。纸片中心间 距≥24mm,纸片中心距平皿边缘≥15mm。 直径90mm的平板最好贴6张。
约 4mm ， 150mm 平 皿 倒 60-70mL ， 100mm平皿倒 25-30mL
冷却至室温，若当天不使用应贮存于
2-8℃冰箱
制备后7天内使用完毕 每批平板均应进行抽样进行无菌试验，
30-35℃孵育24h或更长时间。
pH
检查每批 M-H 琼脂的 pH ，胶化后室温下为
7.2-7.4
内 容
简介
K-B 法 操作方法 报告方式 影响因素 稀释法 E test 联合药敏试验
药物选择及报告
2010年CLSI更新内容简介
目的
指导临床医生针对各类临床感染患者选择
最佳抗菌药物
一定区域内积累对公共卫生有关的重要耐
药的微生物流行病学资料 根据细菌对药物敏感谱进行菌种鉴定
感性解释标准。
对于“不敏感”菌株，鉴定和药敏结果需再次
确认。
解释性报告
某些菌种或菌群对抗菌药物的选择和报告有特 殊要求
大肠埃希菌和克雷伯菌属中产 ESBLs 菌株应
报告对所有青霉素类、头孢菌素类及氨曲南 耐药。
对沙门菌属和志贺菌属的分离株
只有氨苄西林、一种喹诺酮类药物和磺胺异
恶唑/甲氧苄啶可用于常规试验和报告
其 MIC 落在某些范围内提示该菌可能存
在特定的耐药机制（如 β- 内酰胺酶）而 且治疗研究表明其临床疗效不可靠。
不敏感（NS）
M100-S20定义
当药物对菌株的 MIC 高于或抑菌圈直径低
于敏感折点时报告为非敏感。
非敏感并不意味着菌株携带某种耐药机制。 由于耐药菌株缺失或稀少因而仅确立了敏
报告方式
常规报告
敏感
菌株能被使用推荐剂量在感染部位
达到的抗菌药物浓度所抑制
中介
被测菌株对该药物的MIC接近于血液、组
织中通常可达到的浓度而治疗反应率可
能低于敏感株。意味着可通过提高剂量
或在药物被生理浓集的部位发挥临床效
力。
耐药
被测菌不能被该抗菌药物的常用剂量在
组织或血液内达到的浓度所抑制
15min内将平板倒臵放温箱孵育。
注意
纸片一旦贴下就不可再挪动位臵，因纸 片中的药物已扩散到琼脂中。 需要时应在适当的地方贴新纸片
孵育
必须用35℃孵箱（苛氧菌药敏平板应臵于
5% CO2 环境） 箱内平板最好单独摆放，不超过两个叠在 一起，否则中间的平板因达不到孵箱温度 而产生预扩散的作用。
（包括其复合药）
从威胁生命的感染（脑膜炎、菌血症、
会厌炎和面部蜂窝组织炎）患者的血和 脑脊液中分离的流感嗜血杆菌常规应报
告氨苄西林、一种三代头孢菌素和氯霉 素的药敏结果。
“警 告”
下列抗生素/微生物组合，在体外可出现活性 但在临床上无效 ，不应报告敏感
细菌
产ESBL肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯 菌、大肠埃希菌和奇异变形杆菌
生长法
挑选琼脂平板上3~5个形态特征一致的菌 落，用接种环接触每个菌落顶部
转移至4~5mL 适宜的液体培养基中（如
胰酶消化大豆胨肉汤）
臵35℃孵育2-6 h
用无菌生理盐水或肉汤校正，使其浊度至
0.5号麦氏管
直接调制菌悬液法
生长法的简便替代法
从孵育16-24h 的非选择性琼脂培养基
药物纸片 直径6mm纸片，每片吸水量约20μl
菌液比浊管 0.5号麦氏（McFarland）标准比浊管，
菌液浓度为1.5×108/ml
质控菌株
金黄色葡萄球菌 ATCC 25923
大肠埃希菌 ATCC 25922
铜绿假单胞菌 ATCC 27853
操作方法
菌液制备
挑取已纯化的4~5个菌落制备菌悬液
药敏试验原理
纸片扩散法
把含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测
试细菌的琼脂平板上 纸片中药物吸收琼脂水分溶解后通过弥散 作用形成递减的浓度梯度
纸片周围一定距离范围内试验菌生长受抑
制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌环。 抑菌环大小反映测试菌对测定药物的敏感 程度 抑菌环大小除与细菌的敏感性有关外还与 其它诸因素相关。
NAD母液
NAD50mg 溶解于 10ml 蒸馏水，过滤除菌。
HTM
30ml氯化血红素母液加至 1L含 5g酵母粉的
M-H琼脂中
高压灭菌
冷却后用无菌手续加入3ml的NAD母液
淋病奈瑟菌
培养基 GC琼脂+1%的特定生长添加剂
不推荐用高营养的巧克力琼脂作药敏
若10μg青霉素纸片抑菌圈≤19mm ，表示产
圈。
对于甲氧苄啶和磺胺，拮抗物使细菌轻微
生长故抑菌圈直径应忽略细微生长的菌落。
来自血琼脂菌落可能带有足够的甲氧苄啶
或磺胺拮抗物，在 SXT 抑菌圈内细菌可沿敏 感菌株周围产生模糊生长。
检测苯唑西林和万古霉素对葡萄球菌和肠
球菌的抑菌环需要用透射光（平板对着光 源），抑菌环的边缘用放大镜才可发现小菌 落可以忽略。 在纸片周围的抑菌环内有任何可辨的菌落 或生长薄膜（包括针尖样菌落）提示耐药。
类和甲氧苄啶的抑菌效应而使抑菌环变小、 模糊甚至消失而导致假耐药的报告，应使用 胸腺嘧啶核苷含量尽可能低的M-H琼脂。
评价新的 M-H琼脂可用甲氧苄啶 /SMZ 纸片对
粪肠球菌ATCC29212或粪肠球菌ATCC33186进 行试验
不合格培养基
没有抑菌圈
散试验是不可靠的，无菌部位分离的草链应 测其青霉素的MIC。
纸片法特点
适用于肠杆菌科细菌等快速生长的致病菌
无论哪种接种方式，只要质控菌种的抑菌环
在预期范围内，均可按同一解释标准报告药 敏结果 为WHO推荐药敏方法 专性厌氧菌及酵母样菌等某些特殊菌种药敏 试验不能用
技术简单，试剂量低，不需要特殊设备，
解释结果几乎完全相同，交叉耐药性和交叉 敏感性也完全相同，通常只选择一种药进行 试验。
药敏试验中常用试验药及其代表的药物
试验药物 苯唑西林 四环素
菌种
葡萄球菌属 除葡萄球菌和 不动杆菌以外 的所有菌属 革兰阳性球菌 所有菌属
代表药物
所有β-内酰胺类包括酶抑制 剂复合药和碳青霉烯类 多西环素、米诺环素、金霉 素、地美环素、土霉素、美 他环素 罗红霉素、克拉霉素、阿齐 霉素、地红霉素 林可霉素
红霉素 克林霉素
青霉素G
葡萄球菌属 淋病奈瑟菌
苯氧甲基青霉素、苯氧乙 基青霉素、氨苄西林、阿 莫西林、巴氨 西林、氨 环己西林、海他西林、 羧苄西林、美洛西林、阿 洛西林、替卡西林、哌拉 西林
头孢噻吩
肠杆菌科
头孢匹林、头孢拉啶、头 孢氨苄、头 孢克罗、头 孢羟氨苄
氨苄西林
所有菌属
阿莫西林、巴氨西林、氨 环己西林、海他西林
CLSI的解释标准，报告细菌对测试药物敏感、 中介、耐药。
结果判断
在清楚抑菌环内有独立的菌落生长提示
接种的菌落不纯，需要重新分离、鉴定和
药敏试验
抗菌药物选择出的高频突变耐药株
变形杆菌属的菌株可扩散到某些抗菌药物
的抑菌环内，故在明显抑菌环内有薄膜状
爬行生长可以忽略。
链球菌应检测其生长抑制圈而非溶血抑制
米数 测量时应将尺子臵于倒臵的平板上，臵平 板在黑色无反射光背景上方几厘米处并用反 射光照明。 含血的药敏琼脂 应移去平板盖后用反射 光照明平板，于表面上方测量抑菌环。