酶活力测定讲解

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３. 测定步骤
待测酶液的制备：称取酶粉1.000g（或吸取 液体酶1.00ml），先用少量的pH6.0缓冲液溶 解，并用玻璃棒捣研，将上清液小心倾入容量 瓶中，沉渣部分再加入少量缓冲液，如此反复 捣研3-4次，最后全部移入容量瓶中，用缓冲 液定容至刻度（将酶液稀释至被测试液吸光度 在0.12-0.36范围内），摇匀。同过四层纱布过 滤，滤液为待测酶液。
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３. 测定步骤：
待测酶液的制备：同“分光光度法”
测定：取2ml标准终点色溶液于白瓷板孔穴内，作为 比较颜色的标准，其余孔穴各加1.5ml稀碘液。吸取 可 溶 性 淀 粉 溶 液 和 5mLpH6.0 缓 冲 液 于 试 管 中 。 在 60℃恒温水浴中预热10min。然后准备加入0.5mL稀 释酶液，立即记时。充分摇匀。定时用滴管取出约 0.5mL反应液，滴入盛有稀碘液的白瓷板空穴内，当 孔穴内颜色由蓝紫色逐渐变为与标准终点色（红棕色） 相同时即为反应终点，记录反应时间t（min）。
（4）1mol/L硫酸溶液。
（5）0.1mol/LNaOH溶液。
（6）20g/L可溶性淀粉溶液。
（7）200 g/LNaOH溶液。
（8）10g/L淀粉指示剂
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二、物理化学分析法
３.测定步骤 待测酶液的配制，称取酶粉，准确至0.0002g （或吸取液体酶1.00mL），先用少量的乙酸 缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，将上清夜小心 倾入适当的容量瓶中。沉渣部分再加入少量缓 冲液，如此捣研3～4次，最后全部移入容量瓶 中，用缓冲液定容至刻度，摇匀。通过四层纱 布过滤，滤液供测定用。
蛋白酶活力（u/g或u/mL）=A×K×4/10×n
式中A—样品平行实验的平均吸广度；
K—吸光常数；
4—反应液的总体积（mL）；
10—反应时间10min，以1min计；
2019/5/10n—稀释倍数。
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５ .讨论
（1）酪蛋白配制应严格按操作方法，否则 影响测定结果。
（2）若测定固体曲霉时，一般稀释200～ 500倍；酶液则要稀释500倍为宜。
其吸光度。以吸光度为纵坐标，酪氨酸的浓度 为横坐标，绘制标准曲线。
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（2）待测酶液的制备 称取酶粉1-2g，准确至 0.0002g （ 或 吸 取 液 体 酶 1ml ） ， 用 少 量 该 酶 的缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研，然后将上清 夜小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述 缓冲爷，如此溶解、捣研3-4次，最后全部移 入容量瓶中，用缓冲液定容刻度，摇匀。用四 层纱布过滤，滤液根据酶活力再一次用缓冲液 稀释至适当浓度，供测试用（稀释至被测试液 吸光度在0.25-0.40范围内）。
32.2—反应液的总体积（ml）；
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5—吸取反应液的体积（ml） 1/2—吸取酶液2.00ml，以1.00ml计； N—酶液稀释倍数； 2—反应30min，换算成1h的酶活力的系
数。
所得的结果表示至整数。
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第三节 蛋白酶活力测定
１.原理
蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解底物 酪蛋白，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、 色氨酸等）。在碱性条件下，Folin-酚试剂极 不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝与钨蓝， 在一定范围内，蓝色的深浅与酪氨酸的浓度成 正比。这样，可以利用测定蛋白酶在单位时间 内催化酪蛋白产生的酪氨酸的量求得蛋白酶的 活力。
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酶活力测定：
于甲、乙两支比色管中，分别加入可溶性淀粉
溶液25ml和PH4.6乙酸缓冲液5ml，摇匀后至 40℃恒温水浴中预热5min。
在甲管（样品）中加入待测酶液2ml，立刻摇 匀，在此温度下准确反应30min,立刻各加NaOH 溶液0.2ml，摇匀。将两管取出迅速冷却，并于 乙管（空白）中补加待测酶液2ml。吸取上述反 应液各5ml，分别置于碘量瓶中，准确加入碘溶 液10ml，再加0.1mol/LNaOH溶液15ml，摇匀， 密塞，于暗处反应15min。取出，加1mol/L硫酸 溶液2ml，立即用硫代硫酸钠标准溶液滴定，直
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２.试剂
（1）pH 4.6 0.1 mol/L HAc缓冲液；
（N2a）2S02.0O53m·o5l/HL2ONa和2S02.O2g3 N标a2准C溶O2液，用，新称鲜取煮1沸3g 过的冷水溶液并稀释至1000mL配制一周后以 碘酸钾（或重铬酸钾）标定。
（3）0.1mol/L碘溶液 ，棕色瓶保存。
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（3）酶活力的测定 先将酪蛋白溶液放入 40℃恒温水浴中预热5min，然后按下列 程序操作：
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试管A（空白）
试管B（酶样试剂，需作
加酶液1ml
加酶液1ml
40℃，2min
40℃，2min
加三氯乙酸2mL（摇匀） 加酪蛋白1mL（摇匀）
40℃ ， 10min
100ug/mL酪氨酸标准液
1mol/LHCl溶液。
0.5mol/LNaOH溶液。
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３. 测定步骤
（1）标准曲线的绘制 取9支干燥试管，分别加 入酪氨酸标准溶液0，1，2，3，4，5，6，7， 8mL, 补 水 至 10mL, 混 匀 后 ， 从 中 分 别 取 溶 液 1mL,各加0.4mol/L碳酸钠溶液5mL、（1+2） Folin-酚试剂使用溶液1mL,置于40℃水浴中显 色20min，取出，于680nm波长，10mm比色 皿，以不含酪氨酸的0号管为空白，分别测定
甲液：准确称取氯化钴40.2439g和重铬酸钾0.4878g， 用水溶解并定容至500ml。
乙 液 ： 准 确 称 取 铬 黑 T 40mg, 用 水 溶 解 并 定 容 至 100ml。
取甲液40ml与乙液5.0ml混合，即为标准终点色溶液。 该溶液在冰箱内保存，使用15d后需重新配制。
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２.试剂
（1）底物溶液的制备
①称取聚乙烯醇
②量取40g/LPVA溶液150mL，加橄榄油50mL 用高速组织，捣碎机搅动6min（分2次搅动， 每 次 3min ， 中 间 休 息 5min ） ， 即 成 乳 白 色 PVA乳化液。该溶液宜现用现配。如贮存在冰 箱中，有效期为1周。
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５. 讨论
（ 1 ） 商 品 α- 淀 粉 酶 粉 剂 活 力 为 1500 ～ 2500u/g，稀释倍数一般为100～200倍。
（2）可溶性淀粉的质量对α-淀粉酶活力有一 定影响，为统一起见，可溶性淀粉采用浙 江菱湖淀粉厂产的酶制剂专用可溶性淀粉。
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第二节糖化酶活力测定
第十一章、酶活力测定
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第一节、α-淀粉酶活力测定
1、作用 2、分类 3、测定方法
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一、分光光度法
１. 原理
α-淀粉酶广泛存在于植物、哺乳类动物和微 生物中。能将淀粉分子链中的α-１,４葡萄糖甘 键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽 糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈篮紫色的特异性 反应迅速逐渐变红棕色直至消失，其颜色消失 的速度与酶活力有关，故可通过测定反应后吸 光度计算其酶活力．
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10g/L酪蛋白溶液：称取酪蛋白1.000g，准确至 0.001g，用少量0.5mol/L NaOH溶液（若酸性 蛋白酶则用浓乳酸2～3滴）湿润后，加入适量 的各种适宜pH的缓冲溶液约80mL，在沸水浴 中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转 入100mL容量瓶中，用适宜的pH缓冲溶液稀 释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。
１.原理
糖化酶广泛分布于能直接以淀粉为营养
源的所有生物中。糖化酶催化淀粉水解， 从 淀 粉 分 子 非 还 原 性 末 端 开 始 ， 分 解 α1,4葡萄糖苷键生成葡萄糖，葡萄糖分子 中含有醛基，能被次碘酸钠氧化，过量 的次碘酸钠酸化后析出碘，再用硫代硫 酸钠标准溶液滴定，计算出酶活力。
源自文库
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２．试剂
原碘液：称取碘11g 、碘化钾22g用少量水使 碘完全溶解,然后定容至500mL,贮于棕色瓶中.
稀碘液：吸取2mL,加碘化钾20g,用水溶解并 定容至500mL,贮于棕色瓶中。
20g/L可容性淀粉溶液。此溶液需要当天配制。 pH6.0、0.02mol/L Na2HPO4-柠檬酸缓冲液。
至蓝色刚好消失为其终点。不同稀释倍数，应做 相应的空白试验。
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４.计算
酶活单位定义：在上述条件（40℃、 PH4.6 ） 下 ， 1h 分 解 可 溶 性 淀 粉 产 生 1mg葡萄糖的酶量为一个酶活力单位。
糖 化 酶 活 力 （ u/g 或 u/ml)=(V1V2)×c×90.05×32.2/5)×(1/2)×n×2
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２.试剂 Folin-酚试剂见“蛋白质含量测定”。 0.4mol/L碳酸钠溶液。 0.4mol/L三氯乙酸溶液。 缓冲溶液
①PH7.5磷酸缓冲液，适用于中性蛋白酶。 ②pH3.0乳酸缓冲液，适用于酸性蛋白酶。 ③pH10.5硼酸缓冲溶液，适用于碱性蛋白酶。
上述各种缓冲溶液，均须用pH计校正。
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酶活力测定：吸取可溶性淀粉溶液20ml与 试管中，加入pH6.0缓冲液5ml，摇匀后于 60℃恒温水浴中预热10min。加入稀释好 的待测酶液1ml。立刻计时，摇匀，准确 反应5min。立刻吸取反映液1ml于稀碘液 作空白波长660nm，1cm比色皿，迅速测 定吸光度（A）根据吸光度查表，求得测 定酶液的浓度（c）。
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式中V1—空白消耗硫代硫酸钠标准溶液的体积 （mL ）；
V2— 样 品 消 耗 硫 代 硫 酸 钠 标 准 溶 液 的 体 积 （mL ）；
C—Na2S2O3标准溶液的浓度（mol/L）；
90.05—与1.00mL 1mol/L Na2S2O3标准溶液 相当的以g表示的葡萄糖的质量；
40℃ ， 10min
加酪蛋白1mL（摇匀） 三氯乙酸2mL（摇匀）
取出静置10min,过滤； 取1mL滤液 ； 加碳酸钠溶液5mL ；加Folin-酚试剂使用液 1mL；40℃，显色20min；于680nm波长，比 色皿测其吸光度
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４.计算
酶活力单位定义：在上述条件下，1min水解 酪蛋白产生1ug酪氨酸的酶量为一个酶活力单 位
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４.计算
酶活单位定义：在60℃，pH6.0条件下， 1h液化1g可溶性淀粉的酶量为1个酶活力 单位。
α-淀粉酶活力（u/g或u/mL）=c×n
式中c----测试酶液的浓度（u/ml）；
n----样品的稀释倍数。
以结果表示至整数。
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二、目视比色法
１.原理 α-淀粉酶水解淀粉为小相对分子质量的
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第四节 脂肪酶活力测定
１.原理
脂肪酶普遍存在于动、植物各种组织及 许多种微生物中。脂肪酶在一定条件下， 能使甘油三脂水解成脂肪酸、甘油二脂、 甘油单脂和甘油，所稀释的脂肪酸用标 准碱溶液进行中和滴定，用pH计或酚酞 指示剂指示反应终点，根据消耗的碱量， 计量其酶活力。
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４. 计算
酶单位定义：在60℃，pH6.0 条件下，1h液 化1g可溶性淀粉的酶量为一个活力单位。
α- 淀 粉 酶 活 力 （ u/g 或 u/mL ） =20×0.2×60/t×1/0.5×1/m×n
式 中 20---- 可 熔 性 淀 粉 吸 取 量 （ mL ） ； 0.02----1mL 可 溶 性 淀 粉 溶 液 中 含 可 溶 性 淀 粉 质 量 （ g ） ； t---- 酶 解 反 应 时 间 （ min ） ； 0.5----吸取稀释酶液体积（mL）； n----酶 液稀释倍数； m----称取酶粉的质量（g）。
糊精和少量的麦牙糖及葡萄糖，使淀粉 与碘呈蓝紫色反映逐渐变红棕色直至消 失，观察并测定颜色的消失速度可以衡 量酶活力的大小。
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２.试剂 原碘液：同“分光光度法”。
稀碘液：同“分光光度法”。
20g/L可溶性淀粉溶液：同“分光光度法” PH6.0、0.02mol/L Na2HPO4—柠檬酸缓冲液 标准终点色溶液