医学-流式细胞术基本原理
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– 激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。 – 现在仪器常配有仪器选配2-4根激光器，波长多为488nm、
633nm和355nm、405nmUV；
（ 二 ） 光 束 成 行 系 统
细胞流动方向
FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样 本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。
Beckman Coulter流式细胞仪
Epics XL 单激光四色，市场 FC 500 单激光或双激光五色， Gallios 三激光十色，分
覆盖率高，分析型
市场覆盖率高，分析型
析型
CyAn三激光九色，分析型
MoFlo XDP 高端分选型
1.2 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
• 流体动力学聚焦：稳定的液 流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后，有一 个聚焦收缩作用，细胞流直 径被约束在10-20um，避免 了多个细胞重叠进入检测区。
细胞流
激光照射点 流体动力学聚焦示意图
（一）流动室和液流驱动系统
• 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。 流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
（三）光收集系统
• 滤光片的组成
– 长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过； – 短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过； – 带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。
进样孔
鞘液Sheath 荧光信号 激光束
流动室结构图：单细胞发生器
液流驱动系统
（二）进样速率控制
10 psi
10 psi
10.2 psi
10.8 psi
• 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
• 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
流式细胞术
---原理、操作及应用
生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室 地址：西7楼107室 电话：63846590-776423
教学参考书
• 实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2019.4
• 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技Hale Waihona Puke Baidu出版社。 2019.8
• 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出 版社。2019.2
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
1979年 国家科委重点项目： 研制国内第一台激光流式细胞仪；
1982年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生； 1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验收； 1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖； 1985年--1990年 灵敏度、信噪比、更多参数；
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
FACS Verse双激光六色，三 激光八色
BD公司分选型流式细胞仪
FACSVantage SE FACSAria III
Influx
• 实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学 出版社。2019.9
• 流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2019.10
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– 流式细胞术简介 – 流式细胞仪的结构组成 – 流式细胞仪的光信号检测 – 流式细胞术数据的存贮、显示与分析 – 流式分选
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
流式细胞仪的发展及商品化
• 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； • 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； • 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； • 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； • 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； • 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； • 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； • 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流
1.2.2 光学系统
（一）激发光源 ：激光器
• 气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
• 染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激 光器，发出550-650nm可变波长激发光；
• 半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
• 流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准； • WB ：群体分析，得到多个细胞的平均值。
• 光学系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
• 细胞分选系统
– 喷嘴 – 电偏转板 – 样本收集器
1.2.1 液流系统
鞘液
鞘液
• 鞘流技术：根据层流原理发 展起来的技术，可以实现两 种液体的同轴流动，样本细 胞流位于轴心稳定流动，外 面包裹有鞘液(sheath)。
流式分选仪研制开发；
计算机四参数软件；
样品制备、医学生物学应用。
流式细胞仪的分类
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流
式细胞仪一般只用于分选。
BD公司分析型流式细胞仪
633nm和355nm、405nmUV；
（ 二 ） 光 束 成 行 系 统
细胞流动方向
FCM的单细胞照明技术：这种椭圆形光斑的检测区保证样 本中的细胞是一个一个分别受到最大光照。
Beckman Coulter流式细胞仪
Epics XL 单激光四色，市场 FC 500 单激光或双激光五色， Gallios 三激光十色，分
覆盖率高，分析型
市场覆盖率高，分析型
析型
CyAn三激光九色，分析型
MoFlo XDP 高端分选型
1.2 流式细胞仪的结构组成
• 液流系统
– 流动室 – 液流驱动系统
• 流体动力学聚焦：稳定的液 流从截面积较大的部分流入 截面积较小的部分后，有一 个聚焦收缩作用，细胞流直 径被约束在10-20um，避免 了多个细胞重叠进入检测区。
细胞流
激光照射点 流体动力学聚焦示意图
（一）流动室和液流驱动系统
• 流动室(flow cell, flow chamber)是流式细胞仪的核心部件。 流动室中，被测细胞逐个通过，并在此与激光正交。
1.1 流式细胞术简介
• 流式细胞术（Flow Cytometry，FCM）是以流式 细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个 细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量 分析和分选的技术。
• 流式细胞仪（Flow Cytometer ）是集细胞与分子 生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计 算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术 为一体的一种新型高科技仪器。
（三）光收集系统
• 滤光片的组成
– 长通滤片(LP)：只允许特定波长以上的光束通过； – 短通滤片(SP)：只允许特定波长以下的光束通过； – 带通滤片(BP)：只允许一定波长范围内的光束通过。
进样孔
鞘液Sheath 荧光信号 激光束
流动室结构图：单细胞发生器
液流驱动系统
（二）进样速率控制
10 psi
10 psi
10.2 psi
10.8 psi
• 通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并 不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。
• 高速时样本流变宽，单位时间内流经激光照射区的细 胞数就增加，这样会导致变异系数增加。
流式细胞术
---原理、操作及应用
生物化学与分子细胞生物学系 流式实验室 地址：西7楼107室 电话：63846590-776423
教学参考书
• 实用流式细胞术彩色图谱。王树奎、周振英主编。2019.4
• 临床流式细胞分析。王建中主编。上海科学技Hale Waihona Puke Baidu出版社。 2019.8
• 流式细胞术原理与应用教程。吴后男编。北京大学医学出 版社。2019.2
式细胞仪-FACS Ⅰ。 • 1975 Kohler和Milstein: 单克隆抗体技术(促进流式发展)。
1979年 国家科委重点项目： 研制国内第一台激光流式细胞仪；
1982年 国内第一台三参数激光流式细胞仪诞生； 1984年 国家科委组织科研成果的鉴定验收； 1985年 获国家卫生部科技成果乙等奖； 1985年--1990年 灵敏度、信噪比、更多参数；
FACS Calibur 双激光四色， 市场覆盖率最高
LSR II 双激光六色，三激光八色， 四激光十色，分析型最高配
FACS Canto II 双激光六色， 三激光八色
FACS Verse双激光六色，三 激光八色
BD公司分选型流式细胞仪
FACSVantage SE FACSAria III
Influx
• 实用流式细胞术-血液病篇。刘艳荣主编。北京大学医学 出版社。2019.9
• 流式细胞术。陈朱波、曹雪涛编。科学出版社。2019.10
主要内容
• 一、流式细胞仪结构和原理
– 流式细胞术简介 – 流式细胞仪的结构组成 – 流式细胞仪的光信号检测 – 流式细胞术数据的存贮、显示与分析 – 流式分选
• 二、流式细胞术操作与技巧 • 三、流式细胞术在生物医学中的应用
流式细胞仪的发展及商品化
• 1934 Moldavanl: First try (固定式细胞分析-流动式)； • 1953 Crosland-Taylor: 鞘流系统(解决难题)； • 1956 Coulter原理(血细胞计数器)； • 1965 Kamentsky: 分光光度计定量细胞成分和散射光应用； • 1967 Kamentsky等设计了细胞分选的装置； • 1969 Vandilla等: 第一台荧光检测细胞计(鞘流聚焦、激光)； • 1972 斯坦福大学: 研制出荧光激活细胞分选仪(FACS)； • 1973 BD公司与斯坦福大学合作，研制生产第一台商用流
1.2.2 光学系统
（一）激发光源 ：激光器
• 气体激光器：氩离子(488nm、355nm)、氦氖(633nm)、氪离子 (647nm)、氪氩(568nm)；
• 染料激光器：如氩离子激光泵浦的Rhodomin 6G水溶液染料激 光器，发出550-650nm可变波长激发光；
• 半导体激光器：价格低、结构简单、寿命长。BD的FACS Calibur 已采用635nm半导体激光器。
流式细胞术的特点
• 检测对象：单细胞悬液或生物颗粒； • 检测参数：多参数； • 检测特点：单细胞水平分析； • 检测速度：高速，最高达上万个细胞/秒； • 检测结果：精度高、准确性好； • 可对目标细胞进行分选；
• 流式：单个细胞分析，收集每个细胞的数据，更精准； • WB ：群体分析，得到多个细胞的平均值。
• 光学系统
– 激发光源 – 光束收集系统
• 电子系统
– 光电转换器 – 数据处理系统
• 细胞分选系统
– 喷嘴 – 电偏转板 – 样本收集器
1.2.1 液流系统
鞘液
鞘液
• 鞘流技术：根据层流原理发 展起来的技术，可以实现两 种液体的同轴流动，样本细 胞流位于轴心稳定流动，外 面包裹有鞘液(sheath)。
流式分选仪研制开发；
计算机四参数软件；
样品制备、医学生物学应用。
流式细胞仪的分类
• 分析型流式细胞仪
– 细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。
• 分选型流式细胞仪
– 既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选； – 进样管道较长，还需要保持无菌状态，所以分选型流
式细胞仪一般只用于分选。
BD公司分析型流式细胞仪