针剂生产过程内毒素控制方法总结

针剂生产过程内毒素控制方法总结

2012年

一、基本概念

细菌内毒素：只在细菌被破坏时才被释放的细菌毒素。某些革兰阴性菌(如布鲁菌、肠杆菌、奈瑟菌、弧菌等)外膜相关的热稳定毒素，主要成分是脂多糖，在固有免疫及B细胞的多克隆激活中发挥作用。

检测方法：由于内毒素是细菌死亡裂解或自溶引起的，因此环境中大量存在内毒素。当内毒素通过机体消化道等方式时并无危害，少量通过注射等方式进入血液后被肝脏枯否细胞灭活，不造成机体损害。内毒素大量进入血液就会引起发热反应—“热原反应”。内毒素大量进入、集聚于血液中，超过机体各自卫系统的清除能力，则可导致不同程度的内毒素血症。对于易于引入内毒素的药品医疗器械等必须通过内毒素检测。内毒素的检测常用家兔热原法和鲎试验法。中国药典收录的细菌内毒素检查法包括2种方法：凝胶法和光度法（分为浊度法和显色法），使用鲎试剂来定性或定量检测内毒素。

二、内毒素监控体系的构建

控制药品内毒素应从体系上总体控制，药品成分，容器密封件，设备和储存时间限度均在规定的内毒素控制范围内。适当的设备清洁、干燥、存放可以使生物负荷得到控制，防止内毒素的扩散。设备的设计应该使之很容易拆装、清洁、消毒、和/ 或灭菌。在无菌过滤前和无菌过滤后都应该对所有产品接触表面进行内毒素控制。通过高温干热灭菌使内毒素失活，或用经过验证的清洁方法除去设备表面

的内毒素。一些CIP程序开始时用适当的高纯度水或/ 和洗涤剂(如:酸、碱、表面活性剂) 冲洗，然后用热的注射用水作最后冲洗。设备在清洁后要干燥。灭菌级过滤器和湿热灭菌在去除内毒素方面没有显出有效。设计用于去热原的过程应该达到3 位对数内毒素减少。

内毒素监控体系如表1

表1细菌内毒素监控体系

2.1 监控对象

--重要的媒体及原料

水是制药工艺最重要的媒体，是首要的监控对象

使用大量的原料

--生产过程添加的各种辅剂

--与中间体接触的各种用具、器皿及终产品的包装容器

--各工序前后中间体内毒素水平的变化

至少在生产过程的重要工序之间要设置监测点，例如在除热源工序后设置监测

点。又如在分装工序前需抽检，确保中间体内毒素水平不超出控制水平才进行分装。

烘箱等除热源设备的验证

2.2 建立内毒素监控体系的步骤

确定药品的内毒素限值L；

分析药品生产过程，合理设置内毒素监测点；

制定各监测点合理的内毒素控制水平Lx；

进行干扰性验证试验确定各检测样品的有效浓度或有效稀释范围，选择所用鲎试剂的灵敏度；

进行日常的内毒素检测检查。

三、影响针剂内毒素的因素及应对措施

3.1、鲎试剂抗干扰能力

鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和（1,3）-β-葡聚糖激。

3.1.1、鲎试剂灵敏度的差异不同厂家的鲎试剂虽然标示值（λ）相同，但仍然存在较大的误差。比如，标示值为0.5EU/ml的鲎试剂，若有的产品真实灵敏度可能是0.75EU/ml或1.0EU/ml；而另一个厂家的鲎试剂可能是0.35EU/ml或

0.25EU/ml时，按0.5-2λ误差标准都是合格产品，但对同一检品虽然在相同的稀释倍数下，这两个厂家的鲎试剂产品对内毒素的检出水平却不同。

3.1.2、鲎试剂与内毒素脂多糖反应的差异在正常的药品、生物制品生产时，因不同时期的原料来源和水源的因素，都可能导致半成品或成品污染的菌株不同，而导致内毒素脂多糖物质与鲎试剂反应的活性不同。有的鲎试剂对革兰氏阴性菌或各种微生物产生的内毒素脂多糖均有敏感性，有的鲎试剂可能只对革兰氏阴性菌产生的内毒素敏感而对其它微生物产生的内毒素脂多糖不敏感，故同一检品虽然在相同稀释倍数下，不同厂家的鲎试剂对内毒素的检出能力亦不同。

3.1.3、鲎试剂的特异性指在药品、生物制品和血液制品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力，既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物质错判为内毒素。已知能与鲎试剂发生反应的物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点的斜线。鲎试剂的特异性（专属性）差的另一种表现，是将其它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合格药品判为不合格。

3.2、检验方法

鲎试剂与内毒素的反应为一系列酶反应，生物酶反应受许多因素的干扰。在日常

工作中，要特别注意一些因素对试验结果的影响，如PH值、器皿的洁净度以及环境因素等。

图2 鲎试剂与内毒素的反应机理

3.2.1、PH值：鲎试剂生物活性在pH 6-8时酶活性稳定；pH ≤3 或≥10时，酶活性受到抑制。故鲎试验时，供试品pH 最好应预调和6.8-8.0 为好，必要时可用无内毒素的HCl 或NaOH 稀溶液调节pH 值。

鲎试剂生产用水质量和BET水PH值的差异，可影响鲎试剂对内毒素脂多糖反应敏感性。有的鲎试剂生产公司（或厂）的原料用水不是多效蒸馏水，而是利用一般纯化水，而且PH值都在6.0以下。而鲎试剂的酶反应最佳PH值为6.8-8.0，所以一直以来美国、英国药典和日本药局方规定检品必须调节PH值6.0-8.0。

3.2.2、器皿的洁净度：内毒素稀释不宜用注射器，而应用经过校正的刻度玻璃吸管。因为注射器刻度准确度差，而且针栓壁磨沙面易吸附内毒素，试验误差大。同时要特别注意注射器针头引入的铁离子对试验结果的干扰，铁离子对鲎试验反应有较强的抑制作用。操作中常用的聚丙烯塑料管可能干扰试验结果，故宜慎用。

《中国生物制品操作规程》389页——细菌内毒素检查法“玻璃器皿的洗涤”规定：“ 将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥（禁用超纯水或久置的蒸馏水冲洗）后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用新鲜蒸馏水冲洗，禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。”

假如使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的内在质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，应该严格遵守操作规程，用新鲜多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。

3.2.3、金属阳离子：离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离子（如Fe3+）对鲎试剂酶反应具有强抑制作用；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、Mg2+离子，使实验呈假阴性。

3.2.4、其它物质：如血液中的凝血因子、络合剂、抗凝剂等，都可能干扰鲎试剂