腹泻症候群病毒检测SOP

腹泻症候群病毒检测标准程序
一、标本处理（10%便悬液制备）
1.在每管中加入约900µL的轮状病毒标本稀释液（A组轮状病毒试剂盒中附带，为S AMPLE D ILUENT）；
2.在生物安全柜中将每一份粪便标本取100µL（固体取小豌豆大小），加入已标记好的EP管中；
3.用漩涡振荡器剧烈震荡3次，每次10S，静止10MIN，8000RPM离心5MIN；
4.在生物安全柜中取上清进行下一步试验或于-20℃保存。

二、A组轮状病毒ELISA检测（P RO S PECT TM R OTAVIRUS K IT,OXOID)
1．操作步骤如下：
（1）在试剂盒微孔滴定板中每孔加入100µL10%便悬液上清，每批检测样本至少设一个阳性对照和一个阴性对照；
（2）每孔加2滴或100µL酶结合物（C ONJUGATE），盖上盖子，室温（20-30℃）孵育60＋/－5MIN；
（3）甩掉孔内液体，用稀释的洗液（每孔约350-400µL）洗五遍，如果用洗板机洗板，使用前校准洗板机，确保每次洗板完全充满和抽干。

最后一次洗板之后，将微量滴定板在吸水纸上拍打几次，以除去孔内残留洗液；
（4）在每孔内加2滴或100µL底物（S UBSTRATE），盖上盖子，室温（20-30℃）孵育10MIN，此步骤可通过肉眼观察明显的蓝色判定为阳性结果；
（5）也可选择在每孔内加2滴或100µL终止液（S TOP S OLUTION），在30MIN 内进行OD450读数，临界值＝阴性对照OD450值＋0.10，OD450值大于临界值的样本判定为阳性结果。

图一 A组轮状病毒ELISA检测流程
三、核酸提取(可用同时提取病毒DNA和RNA的试剂盒)
QIA AMP®病毒核酸提取试剂盒
（1）在1.5 ML EP管中加入560µL AVL缓冲液（含C ARRIER RNA）。

（2）将140µL10％便悬液加入至EP管中的AVL缓冲液中，漩涡震荡混匀15S。

（3）室温（15～25℃）静止10MIN，瞬时离心；
（4）在EP管中加入560µL 96～100％的无水乙醇，漩涡震荡混匀15S，瞬时离心；
（5）小心加入630µL 步骤4混合液至QIA AMP柱中（已套在收集管上），盖上盖子，8000 RMP离心1 MIN；
（6）弃去收集管中的液体，重复步骤5。

（7）弃去收集管中的液体，小心加入500µL AW1缓冲液，8000 RMP离心1 MIN；
（8）弃去收集管中的液体，小心加入500µL AW2缓冲液，8000 RMP离心1 MIN；
（9）弃去收集管中的液体，13,000RMP离心1 MIN；
（10）将QIA AMP柱放置于一个干净的1.5ML EP管中，向QIA AMP柱膜中央加入40µL AVE缓冲液，室温静止2-5MIN；
（11）8000 RMP离心1 MIN，即得到病毒RNA或DNA溶液，贮存于－20℃或－70℃备用。

四、A组轮状病毒G/P分型检测
轮状病毒Qiagen onestep法RT-PCR 检测(推荐)
G基因型分型的巢式PCR
变性（10µl）
20µM VP7F 1µl
20µM VP7R 1µl
ddH2O 3µl
RNA 模板5µl
98℃变性5分钟，冰内冷却5分钟。

第一轮PCR体系及条件（50µl）：
10 mM dNTPs 2µl
5× buffer 10µl
Enzyme mix 2µl
RNase inhibitor 0.5ul
ddH2O 25.5µl
变性产物10µl
50℃ 30min —— 95℃ 15min ——（94℃ 30sec ——42℃ 30sec——72℃ 1min）×30——72℃ 7min
第二轮PCR体系及条件（20µl）：
2× Mix 10µl
20µM aBT1-aAT8,G3,G9 各0.5 µl
20µM VP7R 0.5µl
H2O 5.5µl
第一轮PCR产物1µl
94℃ 3min ——（94℃ 30sec ——42℃ 30sec——72℃ 1min）×35——72℃ 7min
P基因型分型的巢式PCR
变性（10µl）
20µM VP4F 1µl
20µM VP4R 1µl
ddH2O 3µl
RNA 模板5µl
98℃变性5分钟，冰内冷却5分钟。

第一轮PCR体系及条件（50µl）：
10 mM dNTPs 2µl
5× buffer 10µl
Enzyme mix 2µl
RNase inhibitor 0.5ul
ddH2O 25.5µl
变性产物10µl
50℃ 30min —— 95℃ 15min ——（94℃ 30sec ——42℃ 30sec——72℃ 1min）×30——72℃ 7min
第二轮PCR体系及条件（20µl）：
2× Mix 10ul
20µM 2T1-5T1,P[11], 1T_1D 各0.5µl
20µM VP4F 0.5µl
H2O 5.5µl
第一轮PCR产物1µl
94℃ 3min ——（94℃ 30sec ——42℃ 30sec——72℃ 1min）×35——72℃ 7min
3. 检测结果的判定：
取10µl RT-PCR扩增产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。

根据特异性核酸条带大小判断G,P基因型。

五、B/C组轮状病毒、诺如病毒（GI和GII）、札如病毒、星状病毒、腺病毒多重PCR检测
1．多重RT-PCR检测方法
（1）反转录：
RT反应：
5×first strand buffer
dNTP（各10mmol/L）
DTT（10mmol/L）SuperScriptII逆转录酶（200U/µl）Random Primer（0.5µg/µl）RNA酶抑制剂（40U/ul）
DEPC处理H2O
病毒核酸2.05μl 0.75μl 0.75μl 0.5μl 0.75μl 0.5μl 2.2μl 7.5μl
42℃反转录1hr,99℃灭活反转录酶5min，迅速放入冰内；
（2）PCR反应：以上述反转录产物为模板进行PCR扩增， PCR体系如下所示：①B/C组轮状病毒：
10× Taq Buffer
dNTP（各2.5mol/L）MgCl2（25mmol/L）
Taq DNA聚合酶（5 U/µl）B5-2（33μmol/L）
B5-3（33μmol/L）
NG8S1（33μmol/L）
NG8S1（33μmol/L）cDNA
ddH2O至
2.5μl
2.0μl
2.0μl 0.125μl
0.2μl
0.2μl
0.2μl
0.2μl
2.5μl
25μl
②诺如病毒和札如病毒：
10× Taq Buffer
dNTP（各2.5mol/L）MgCl2（25mmol/L）
Taq DNA聚合酶（5 U/µl）GI-SKF（33μmol/L）
GI-SKR（33μmol/L）CoG2F（33μmol/L）
GII-SKR（33μmol/L）SLV5317（33μmol/L）SLV5749（33μmol/L）cDNA
ddH2O至
2.5μl
2.0μl
2.0μl 0.125μl
0.2μl
0.2μl
0.2μl
0.2μl
0.2μl
0.2μl
2.5μl
25μl
③星状病毒：
10× Taq Buffer 2.5μ
dNTP（各2.5mol/L）MgCl2（25mmol/L）
Taq DNA聚合酶（5 U/µl）Mon269（33μmol/L）Mon270（33μmol/L）cDNA
ddH2O至l
2.0μl
2.0μl 0.125μl
0.2μl
0.2μl
2.5μl
25μl
④腺病毒（直接以提取的核酸为模板）：
10× Taq Buffer
dNTP（各2.5mol/L）MgCl2（25mmol/L）
Taq DNA聚合酶（5 U/µl）Ad1（33μmol/L）
Ad2（33μmol/L）
病毒核酸
ddH2O至
2.5μl
2.0μl
2.0μl 0.125μl
0.2μl
0.2μl
2.5μl
25μl
PCR反应参数：
94℃预变性5min，35个循环（94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min），72℃终延伸7min，4℃终止反应。

（3）琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，DNA Marker用100bp作为参照，不同病毒预期大小如下所示：
病毒名称产物大小
B组轮状病毒814bp
C组轮状病毒352 bp
诺如病毒（GI）330 bp
诺如病毒（GII）387 bp
札如病毒434 bp
星状病毒449 bp
腺病毒482 bp。