生化分离工程5亲和纯化教学教案

5.3.1 亲和膜分离
• 原理和特点 • 亲和膜（affinity membrane）是利用亲和配
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• 非特异性洗脱法 • 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH值、离子强
度、离子种类或温度等理化性质降低目标产物 的亲和吸附作用，是使用较多的洗脱方法。
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8.2.3 应用举例
1. t-PA的纯化
• 组织纤溶酶原激活剂（t-PA）是一种糖蛋白， 具有激活纤溶酶原、促进血纤维蛋白溶解的作 用，是治疗血栓等心脑血管疾病的蛋白药物。
5.2 亲和色谱
• 亲和色谱的特点 ①选择性高、特异性极强 ②操作条件温和 ③回收率高 • 亲和色谱的局限性 ①普遍性、通用性不够 ②费用高
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5.2.1 亲和色谱填料
• 亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的， 需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定 相粒子，制备所需的亲和吸附介质。
• 不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋 白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的 结合常数有所不同。
• A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合 能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免 疫复合体。
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4. 凝集素
• 凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质 （酶和抗体除外）的总称。
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图5-2 间隔臂的作用
• 在上述配基固定化方法中，环氧基活化法中的 双环氧化合物起间隔臂的作用。
• 事实上，除CNBr活化法外，其他活化法都引入 了不同的活性基因，这些活性基团如果有适当 的长度，都可起到间隔臂的作用。
• 利用CNBr活化法固定小分子配基时，一般需先 引入ω-氨基已酸或1,6-二氨基已烷后再用相应 的方法固定配基。
• Cu2+，Ni2+，Zn2+和Co2+等过渡金属离子可通 过与亚胺二乙酸（IDA）或三羧甲基乙二胺（ TED）形成螯合金属盐固定在固定相粒子表面 ，用做亲和吸附蛋白质的配基。
• 这种利用金属离子为配基的亲和色谱一般称为 金属螯合色谱（metal chelate chromatography）或固定化金属离子亲和色谱 （immobilized metal affinity chromatography ，IMAC）。
和赖氨酸等。
2. 抗体
• 利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱 （immunoaffinity chromatography）。抗体与 抗原之间的Keq一般为107～1012 L/mol。
• 因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质 类生物大分子的有效手段。
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3. A蛋白
• protein A为分子量约42 kD的蛋白质，与IgG具 有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc 片段。A蛋白分子上含有5个Fc片段可结合部 位。
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• 利用con A为配基的目标产物可用葡萄糖溶液洗 脱。
• 特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于保护目 标产物的生物活性，另外，由于仅特异性洗脱 目标产物，对于特异性较低的亲和体系（例如 ，用三嗪类色素为配基时）或非特异性吸附较 严重的物系，特异性洗脱法有利于提高目标产 物的纯度。
2. 干扰素的纯化
• 干扰素（interferon，IFN） 对癌症、肝炎等疾 病具有特殊疗效。
• IFN主要分α、β和γ三种类型，可通过动物细胞 培养或重组DNA大肠杆菌发酵大量生产。
• 色素亲和色谱、固定化金属离子亲和色谱和免 疫亲和色谱可用于IFN的纯化。
• 如图5-3是利用单抗免疫亲和色谱法纯化源于大 肠杆菌的重组人白细胞干扰素（rhIFN- α）的 操作条件和结果。rhIFN- α的比活提高了1150 倍，收率达95％。
• 少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴 刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）。
• 在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化 的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的 需要，有必要自制亲和吸附介质。
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• 亲和配基 1. 酶的抑制剂 • 小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸
3. 硅胶的活化 • 活化硅胶常采用硅烷化试剂，如γ-氨丙基三甲（
乙）氧硅烷和环氧丙基三甲基硅烷等，反应为：
• 引入活性氨基或环氧基后，在酸性溶液中环氧基 可发生二醇化反应：
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4. 间隔臂 • 当配基较小时，将其直接固定在载体上，会由
于载体的空间位阻，配基大分子不能发生有效 的亲和吸附作用。 这时，需要在配基 与载体之间连接一 个“间隔臂（spacer）”， 使其发生有效的亲 和结合。
作用等。
2. pH • -羧基的pKa＝3.4～3.8 • -羧基的pKa＝3.9～4.0 • -氨基的pKb＝7.4～7.5 • -氨基的pKb＝10.0～10.4
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3. 抑制氢键形成的物质 • 脲和盐酸胍（guanidinohydrochloric acid）
的存在可抑制氢键的形成。
• 利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理 进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（ affinity purification）。
• 亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞细胞。
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5.1.2 影响亲和作用的因素
1. 离子强度 • 离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互
• Triazine dyes是一类分子内含有三嗪环的合成 染料，与NAD的结合部位相同，又称为生体模 拟色素（biomimetic dye）。除脱氢酶和激酶 外，三嗪类色素还与血清白蛋白、
干扰素、核酸酶和糖解酶
等具有很高的亲和力。
• Cibacron Blue F3GA ：
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7. 过渡金属离子
• 引入间隔臂的长度是有一定限制的，当间隔臂 超过一定长度时，配基与目标分子的亲和力又 会减弱。
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5.2.2 亲和色谱洗脱方法
• 特异性洗脱法 • 利用含有与亲和配基或目标产物具有亲和结合
作用的小分子化合物溶液为洗脱剂，通过与亲 和配基或目标产物的竞争性结合，脱附目标产 物。 • 例如：Lys和Arg均为t-PA的抑制剂，利用固定 化Lys为配基亲和分离t-PA时，可用Arg溶液进 行洗脱。
5. 亲和纯化
• 生物亲和作用 • 亲和色谱 • 膜亲和过滤法 • 亲和双水相萃取 • 亲和反胶团萃取 • 亲和沉淀 • 磁性亲和分离
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5.1 生物亲和作用
• 生物亲和作用的本质 • 影响亲和作用的因素 • 亲和作用体系
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5.1.1 生物亲和作用的本质
• 生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲 和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity ）。
• 亲和色谱填料载体 • 亲和色谱的理想载体应具有下列特性： ①不溶性； ②渗透性； ③高硬度及适当的颗粒形式； ④最低的吸附力； ⑤较好的化学稳定性； ⑥抗微生物和酶的侵蚀； ⑦亲水性； ⑧具有大量的供反应的化学基团。
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• 常规的亲和色谱填料都是以软质凝胶，诸如葡 聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等作为载体材料的 。
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图5-4 单抗免 疫亲和色谱法 纯化rhIFN-α
5.3 膜亲和过滤法
• 自20世纪80年代中期以来，把亲和色谱技术和 膜分离技术两种技术有机地结合，出现了膜亲 和过滤方法 。
• 膜亲和过滤方法包括两个分支： • 亲和膜分离技术 • 亲和错流过滤
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5. 辅酶和磷酸腺苷
• 脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。 辅 酶 主 要 有 NAD （ nicotinamide adenine dinucleotide）、 NADP（NAD phosphate）和 ATP（adenosine triphosphate）等。这些辅酶 可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。
• 近年来，为了满足快速高效分离的需要，以多 孔硅胶和合成高分子化合物为载体的高效AFC 色谱填料，得以迅速发展。
• 亲和色谱填料的制备过程一般包括：载体（ carrier、support）的选择、载体的活化和配基 的连接。
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• 部分商品化的色谱填料见表5-2。
表5-2 部分商品化的色谱填料
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• 载体的活化和配基的连接 1. 溴化腈活化法 • 用于多糖凝胶的活化，固定活性基团为氨基的
配基（R-NH2）。溴化腈（CNBr）对多糖类载 体的活化在碱性（pH＞10）条件下数分钟即可 完成，之后的配基修饰亦需在碱性条件进行， 一般使用碳酸盐缓冲液。反应过程为：
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• 赖氨酸、精氨酸、氨基苄脒和纤维蛋白与t-PA 具有亲和结合作用，常用做亲和色谱纯化t-PA 的配基。
• 图5-3是利用精氨酸-Sepharose 4B亲和色谱法 纯化猪心组织t-PA的结果。原料为猪心丙酮粉 经醋酸钾抽提、硫酸铵沉淀。
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图5-3 精氨酸-
Sepharose 4B 亲和色谱
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8. 组氨酸 • 组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用：静电和
疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。 • 在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质pI的溶液
中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度增大，亲和吸附作用降低。
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5. 肝素 • 肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、
• 一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配 基（ligand），用L表示。
• Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～ 108 L/mol，最高可达到1015 L/mol 。
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特异性 高特异性 群特异性
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表5-1 常用的亲和作用体系
亲和作用体系 抗原----单克隆抗体 荷尔蒙----受体蛋白 核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶----底物、产物、抑制剂 免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白 酶----辅酶 凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质----肝素 酶、蛋白质----活性色素（染料） 酶、蛋白质----过度金属离子 酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）
2. 环氧基活化法 • 可 的用 配于 基固。定常分用子 的结 活构 化为 试剂R-为NH12,4、-丁R-二OH醇和-二R缩-S水H
甘油醚（BGE）和环氧氯丙烷。 • 以活化羟基为例：
• 或引入活性基团环氧基后，可采用下述直接法 或间接法（氧化法、碳二亚胺法、戊二醛法） 固定配基。 2020/9/30
• AMP（adenosine 5'-monophosphate）、 ADP （adenosine 2'，5'-diphosphate）的腺苷部分 与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和 配基。
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6. 三嗪类色素
• 利用色素为配基的亲和色谱法又称色素亲和色 谱（Dye-ligand affinity chromatography）。Βιβλιοθήκη Baidu
• 伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，con A） 可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子 的分析、纯化。pH＜5.6时con A为二聚体， 分子量为52 kD；pH＞5.6时为四聚体，分子 量为102 kD，两个亚基（subunit）之间通过 二硫键结合。因此，在利用con A为配基的亲 和色谱操作中，操作条件应当适宜。
肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5 至30 kD，具有抗凝血作用。 • 肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核 酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和 作用，可用作这些物质的亲和配基。 • 肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液 中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低。
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4. 温度 • 温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减
弱；疏水性相互作用增强 。
5. 离液离子 • 在SCN－，I－和ClO4－等离液阴离子存在下
，疏水相互作用降低。
6. 螯合剂
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5.1.3 亲和作用体系
• 将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联 ，可特异性结合另一种分子（目标产物） ，使 其从混合物中高选择性地分离纯化。