第九章植物线虫的基本研究
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取固定24h以上的线虫放进盛有甲溶液的小皿内，将 小皿放进干燥器隔板上，干燥器底部放95%酒精， 加盖后置35-40℃温箱内12-24h，取出小皿，换进 乙溶液，将小皿放进密闭的大器皿内，40℃保存3h 或更长，直至酒精完全蒸发。
3、玻片的制作
蜡圈制作法：直径1.5cm的打孔器，端部烧 热，迅速插到低熔点的石蜡（熔点54℃） 中，将熔化的蜡尽快黏附在载玻片中央， 做成蜡圈；在蜡圈中央加一小滴甘油；将 已脱水的线虫挑入其中；加盖玻片；加热 使蜡熔化；封片。
• 对于较长、弯曲的虫体，需要分段测量，
或通过显微绘图，将虫体画到纸上后再测 量。
• De Man公式
植物线虫的培养
植物线虫一般都是专性寄生物，很难在纯培养 基上生长，只能在相应的寄主植物上生长。
（1）消毒：培养线虫前一般先进行消毒，保 证其是无外源的。通常是用0.1%-0.5%的硫 酸链霉素泡5-15min（不同的线虫，浸泡时 间不同），再用无菌水漂洗3次。
植物线虫的染色
由于线虫透明，一些内部结构较难观 察，因此可进行染色，增强反差。
• 多色蓝：染色后的线虫肠呈绿色，生殖器
官与卵原细胞或精原细胞呈蓝紫色，细胞 核为浅红色，染色体为蓝紫色，其他器官 如神经环、神经细胞等呈深蓝色或深紫色。
• 醋酸地衣红与丙酸地衣红
植物组织内线虫的染色
方法多种，共同特点是经过染色处理，线 虫着色，植物组织不着色或着色很浅。 （1）次氯酸钠-酸性品红染色 （2）棉蓝或酸性品红乳酚油染色法 （3）弗莱明染色液 （4）猩红R染色液
块田取0.5－1kg土样，连同部分根系一起采集，采样时一般 采集长势较差的植物。
3.样本的保存 采样时作好记录，时间、地点、作物，大型作物挂牌。样
本保存在5－10℃冰箱，袋口扎住，稍透点气。若无冰箱，则 放在阴凉处，打开袋口，最好马上分离。
植物线虫的分离
1.从植物病组织中分离线虫的方法
（1）直接解剖分离 分离根结等内寄生线虫的成熟雌虫，简单且快速，但只适 合分离病组织中虫体较大的线虫。
1ml
蒸馏水
wk.baidu.com
40ml
优点：可保持线虫的刻线和环纹清晰
缺点：可能会使虫体洲缩变形
• FA固定液（福尔马林-冰醋酸固定液）
4:1用量 4:10用量
福尔马林（40%甲醛） 10ml 10ml
冰醋酸
1ml 10ml
蒸馏水
89ml 80ml
优点：可长时间保存线虫原形
缺点：可能使虫体颜色变暗，会使垫刃线虫的 口针变透明
第九章、植物线虫的基本研究方法
• 植物线虫的采集和保存：
应根据取样目的和具体的病害特点来制定取样计划和确定 取样方法。
1.病变组织的采集 病变部位，一般也是线虫的存在部位。如：根结，小麦粒
线虫危害引起的虫瘿等。
2.病根、根际土壤和大田土样的采集 在离地表5－20cm的根际取样，遵循少量多点的原则，每
• 杀死与固定同时进行
4:1的FA固定液（福尔马林-冰醋酸固定 液）加热到99℃后倒入高度浓缩的线虫悬 浮液
2、脱水 制作永久玻片和半永久玻片的线虫需要固定后
脱水，用于脱水的线虫必须固定24h以上。
甘油酒精脱水法： 甲溶液：酒精（95%）20ml，甘油1ml，蒸馏水79ml 乙溶液：酒精（95%）95ml，甘油5ml
• TAF固定液（三乙醇胺-福尔马林固定液）
福尔马林（40%甲醛） 7ml
三乙醇胺
2ml
蒸馏水
91ml
优点：短时间内可较好保持线虫的弹性
缺点：时间过长，会导致一些线虫内部结构
透明和表皮角质膜变质。
• FAA固定液（福尔马林-冰醋酸-酒精固定液）
95%酒精
20ml
福尔马林（40%甲醛）
6ml
冰醋酸
（3）胞囊漂浮器分离法
(1)淋湿漂浮筒和下筛。 (2)漂浮简内灌满清水。 (3)在L筛中放风干土样100g左右，用强水 流冲洗，使土样全部被淋洗进漂浮筒内。进 入筒内的土粒因为轻重，逐渐沉向筒底，较 轻的胞囊和一些有机杂物则陆续向上漂浮， 经1—2min后全部漂浮于筒口水面上。 (4)经过上筛加水至漂浮筒内，使游离于 筒门表面的胞囊和杂物沿环须水槽流到下筛 (60目)上面。 (5)淋洗下筛内含有胞囊的残留物至 1000m1的三角瓶内，胞囊和杂物都漂浮在 瓶先端。 (6)用滤纸过滤，收集上述漂浮物，在滤 纸上待在。
（线虫比重约1.05）
• 简要步骤如下：
（a）40g土样中加约150ml水，混成悬浮液， 2000转/min离心5分钟；
（b）弃上清液（此时线虫沉于泥土中）； （c）加入蔗糖液，马上搅匀，立即离心
（2000转/min离心5分钟）， 此时线虫分布在糖液中；
（d）立即过筛，冲洗，收集线虫。
该方法快速，可分离到较多 的线虫，所获得的线虫悬浮 液干净，但不容易获得活线虫。
（4）贝曼漏斗分离 （5）浅盘分离法
贝曼漏斗，过筛，离心这三种是最基 本的分离方法。
植物线虫玻片标本的制作
1、线虫的杀死和固定 （1）热杀死：60-65℃ 约3min；线虫悬浮液
内加沸水使温度为56-58℃， 3min后防入 冰箱或室温自然降温。 （2）固定：线虫杀死后应马上固定，防止变 形和变质。
（2）漏斗分离
适用于分离植物材料和土壤中较活跃的线虫，方法简便，容易 操作，缺乏氧气，但不利于活动线虫的存活，分离效率低。
（3）浅盘分离
原理与漏斗法相同，但通气状况更 好，线虫容易活动，存活率高，分离效 率比漏斗法高，然而分离时间较长，所 获线虫悬浮液较脏。
2.从土壤中分离线虫
（1）直接过筛分离
线虫的计数
• 线虫样品的计数：线虫数量不多可在小培
养皿或线虫计数皿中，在解剖镜下直接计 数；数量多时，先充分搅拌和适当稀释 后，吸取5-10ml线虫悬浮液进行计数。
• 根组织内线虫的计数：先进行染色，再在
解剖镜下计数每段根组织中的线虫数。
植物线虫形态计测
• 对于比较短而直的部位，可直接在高倍光
学显微镜下，通过目镜测微尺测量；
• 60－100目筛，可收集到胞囊 • 325－400目筛，可收集到大多数
线虫
• 500目，可收集到根结线虫的卵 • 用洗瓶冲（两面都冲），筛稍倾
斜， 使冲致一角落，用瓶或皿收集。
可在短时间内处理大量样品， 但方法粗糙，所获线虫悬浮 液较脏。
（2）离心飘浮分离
• 线虫可飘浮在比重为1.12－1.20的蔗糖液中
3、玻片的制作
蜡圈制作法：直径1.5cm的打孔器，端部烧 热，迅速插到低熔点的石蜡（熔点54℃） 中，将熔化的蜡尽快黏附在载玻片中央， 做成蜡圈；在蜡圈中央加一小滴甘油；将 已脱水的线虫挑入其中；加盖玻片；加热 使蜡熔化；封片。
• 对于较长、弯曲的虫体，需要分段测量，
或通过显微绘图，将虫体画到纸上后再测 量。
• De Man公式
植物线虫的培养
植物线虫一般都是专性寄生物，很难在纯培养 基上生长，只能在相应的寄主植物上生长。
（1）消毒：培养线虫前一般先进行消毒，保 证其是无外源的。通常是用0.1%-0.5%的硫 酸链霉素泡5-15min（不同的线虫，浸泡时 间不同），再用无菌水漂洗3次。
植物线虫的染色
由于线虫透明，一些内部结构较难观 察，因此可进行染色，增强反差。
• 多色蓝：染色后的线虫肠呈绿色，生殖器
官与卵原细胞或精原细胞呈蓝紫色，细胞 核为浅红色，染色体为蓝紫色，其他器官 如神经环、神经细胞等呈深蓝色或深紫色。
• 醋酸地衣红与丙酸地衣红
植物组织内线虫的染色
方法多种，共同特点是经过染色处理，线 虫着色，植物组织不着色或着色很浅。 （1）次氯酸钠-酸性品红染色 （2）棉蓝或酸性品红乳酚油染色法 （3）弗莱明染色液 （4）猩红R染色液
块田取0.5－1kg土样，连同部分根系一起采集，采样时一般 采集长势较差的植物。
3.样本的保存 采样时作好记录，时间、地点、作物，大型作物挂牌。样
本保存在5－10℃冰箱，袋口扎住，稍透点气。若无冰箱，则 放在阴凉处，打开袋口，最好马上分离。
植物线虫的分离
1.从植物病组织中分离线虫的方法
（1）直接解剖分离 分离根结等内寄生线虫的成熟雌虫，简单且快速，但只适 合分离病组织中虫体较大的线虫。
1ml
蒸馏水
wk.baidu.com
40ml
优点：可保持线虫的刻线和环纹清晰
缺点：可能会使虫体洲缩变形
• FA固定液（福尔马林-冰醋酸固定液）
4:1用量 4:10用量
福尔马林（40%甲醛） 10ml 10ml
冰醋酸
1ml 10ml
蒸馏水
89ml 80ml
优点：可长时间保存线虫原形
缺点：可能使虫体颜色变暗，会使垫刃线虫的 口针变透明
第九章、植物线虫的基本研究方法
• 植物线虫的采集和保存：
应根据取样目的和具体的病害特点来制定取样计划和确定 取样方法。
1.病变组织的采集 病变部位，一般也是线虫的存在部位。如：根结，小麦粒
线虫危害引起的虫瘿等。
2.病根、根际土壤和大田土样的采集 在离地表5－20cm的根际取样，遵循少量多点的原则，每
• 杀死与固定同时进行
4:1的FA固定液（福尔马林-冰醋酸固定 液）加热到99℃后倒入高度浓缩的线虫悬 浮液
2、脱水 制作永久玻片和半永久玻片的线虫需要固定后
脱水，用于脱水的线虫必须固定24h以上。
甘油酒精脱水法： 甲溶液：酒精（95%）20ml，甘油1ml，蒸馏水79ml 乙溶液：酒精（95%）95ml，甘油5ml
• TAF固定液（三乙醇胺-福尔马林固定液）
福尔马林（40%甲醛） 7ml
三乙醇胺
2ml
蒸馏水
91ml
优点：短时间内可较好保持线虫的弹性
缺点：时间过长，会导致一些线虫内部结构
透明和表皮角质膜变质。
• FAA固定液（福尔马林-冰醋酸-酒精固定液）
95%酒精
20ml
福尔马林（40%甲醛）
6ml
冰醋酸
（3）胞囊漂浮器分离法
(1)淋湿漂浮筒和下筛。 (2)漂浮简内灌满清水。 (3)在L筛中放风干土样100g左右，用强水 流冲洗，使土样全部被淋洗进漂浮筒内。进 入筒内的土粒因为轻重，逐渐沉向筒底，较 轻的胞囊和一些有机杂物则陆续向上漂浮， 经1—2min后全部漂浮于筒口水面上。 (4)经过上筛加水至漂浮筒内，使游离于 筒门表面的胞囊和杂物沿环须水槽流到下筛 (60目)上面。 (5)淋洗下筛内含有胞囊的残留物至 1000m1的三角瓶内，胞囊和杂物都漂浮在 瓶先端。 (6)用滤纸过滤，收集上述漂浮物，在滤 纸上待在。
（线虫比重约1.05）
• 简要步骤如下：
（a）40g土样中加约150ml水，混成悬浮液， 2000转/min离心5分钟；
（b）弃上清液（此时线虫沉于泥土中）； （c）加入蔗糖液，马上搅匀，立即离心
（2000转/min离心5分钟）， 此时线虫分布在糖液中；
（d）立即过筛，冲洗，收集线虫。
该方法快速，可分离到较多 的线虫，所获得的线虫悬浮 液干净，但不容易获得活线虫。
（4）贝曼漏斗分离 （5）浅盘分离法
贝曼漏斗，过筛，离心这三种是最基 本的分离方法。
植物线虫玻片标本的制作
1、线虫的杀死和固定 （1）热杀死：60-65℃ 约3min；线虫悬浮液
内加沸水使温度为56-58℃， 3min后防入 冰箱或室温自然降温。 （2）固定：线虫杀死后应马上固定，防止变 形和变质。
（2）漏斗分离
适用于分离植物材料和土壤中较活跃的线虫，方法简便，容易 操作，缺乏氧气，但不利于活动线虫的存活，分离效率低。
（3）浅盘分离
原理与漏斗法相同，但通气状况更 好，线虫容易活动，存活率高，分离效 率比漏斗法高，然而分离时间较长，所 获线虫悬浮液较脏。
2.从土壤中分离线虫
（1）直接过筛分离
线虫的计数
• 线虫样品的计数：线虫数量不多可在小培
养皿或线虫计数皿中，在解剖镜下直接计 数；数量多时，先充分搅拌和适当稀释 后，吸取5-10ml线虫悬浮液进行计数。
• 根组织内线虫的计数：先进行染色，再在
解剖镜下计数每段根组织中的线虫数。
植物线虫形态计测
• 对于比较短而直的部位，可直接在高倍光
学显微镜下，通过目镜测微尺测量；
• 60－100目筛，可收集到胞囊 • 325－400目筛，可收集到大多数
线虫
• 500目，可收集到根结线虫的卵 • 用洗瓶冲（两面都冲），筛稍倾
斜， 使冲致一角落，用瓶或皿收集。
可在短时间内处理大量样品， 但方法粗糙，所获线虫悬浮 液较脏。
（2）离心飘浮分离
• 线虫可飘浮在比重为1.12－1.20的蔗糖液中