基因组学课件基因组测序与序列组装
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上，冰水混合物为好
技术的多样性和灵活性
4.1.2 化学降解法
基本原理 在选定的核苷酸碱基中引入化 学基团再经化合物处理使DNA分子在被 修饰的核苷酸位置降解
图4.7 化学降解测序法
M-G法所用的化学修饰技术
碱基 G A+G
C+T C
特异修饰方法 pH 8.0，用硫酸二甲酯对N7进行甲基化，使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 pH2.0，哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化，从 而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的 糖苷键
）
位于第6号染色体，全长3.6 x 106 bp，与人类免 疫系统有关
诸如类风湿关节炎，牛皮藓等炎症以及从癌症到 阅读障碍等不同的疾病均与该区的遗传缺陷有关 （Beck，1999）
人类MHC区由224个基因座组成，其中有93个座 位（41.5%）是直接通过基因组测序发现的
人类MHC区是迄今为止已测序的人类基因组中基 因分布最密集的区域，平均每16 kb含一个基因， 也是多态性最丰富的区域，有些座位等位基因成 员超过200
化学降解法（Chemical degradation method ）（Maxam and Gilbert, 1977）
原理：双链DNA分子经化学试剂处理，可在特 定的核苷酸位点产生切口。用同位素标记测序 碱基，以此确定顺序组成
4.1.1 链终止法测序
技术要点 : 制备相同的单链模板DNA 加入少量的双脱氧核苷酸（ dideoxynucleotide，ddNTP）
技术路线与要求
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA（单链→ 双链→ 单链） C 噬粒克隆DNA (helper) →单链 D PCR产生单链DNA
加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
A 高聚合酶活性 B 5’→3´外切酶活性？ C 3´→5´外切酶活性？
c就是负责与人进行交互作用的 电脑装置
454生命科学公司
Watson血液样本，给DNA的老爸 做一份基因组图谱---100天
Solexa基本原理
基因组DNA被随机打断成为小的DNA片断；并在DNA片断的两端连上接头 (adapter)
Solexa测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（Primer ）,单链状态的DNA片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端“锚定”在芯 片上
• 脱氧三磷酸核苷酸连接到 DNA 3’-末端时会释放1个焦 磷酸(PPi)
• 焦磷酸在磷酸化酶的作用下 转化为化学能,并发出光亮
• 往反应液中每次只加入1种 核苷酸,当加入的核苷酸结合 时,反应液发出亮点,并记录 核苷酸种类
• 当核苷酸未结合时,反应液中 的核苷酸酶迅速分解此核苷 酸,由此来测定DNA序列
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
非常规DNA测序——光点测序
• 光点测序
通过扩增反应使得单链DNA成为双链DNA 双链再次变性后成为单链，其一端“锚定”在测序芯片上，另外一端（5’或
3’）随机和附近的另外一个引物互补，被“锚定”住，形成“桥“(bridge) 在测序芯片上同时有上千万DNA单分子发生以上的反应 4中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连接 的是氢原子,不是羟基
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
图4.1
链终止 法测序
图4.2 用于测序的DNA多聚酶
用于测序的DNA多聚酶
Klenow多聚酶
特点 ：
一个典型的反应可以在4小时内测出2千5百 万个碱基，准确率可达到99％
SangБайду номын сангаасr毛细管电泳法测序平均每个小时可读 6万7千个碱基，平均准确率为99.4％
PCR反应：
随机切割基因组，将双链解旋，给单链的 DNA加上接头
每颗珠子带有自己特有的单一的DNA片段， 然后在倒入的含有PCR必需试剂的乳胶颗粒 中发生PCR反应，PCR在不同的地方终结使珠 子带有同一DNA模板的不同拷贝的DNA
590kb，5人8周
局限
大基因组，结构过于复杂，序列组装的起始阶 段工作量非常大
小重复顺序及其数量，在顺序组装时可能出现 错误连接
美国斯坦福大学：
Celera Genomics公司果蝇基因组注释，29%完全正确，26%基本正确，45%有严重错误
4.2.2 限定测序与序列组装
在一些已经绘制了遗传图与物理图的生 物基因组测序中，先进行各个克隆的随 机测序，再按照基因组物理图进行序列 组装，即重叠克隆群测序
肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易 于除去 在1.5mol/L NaCl存在时，可用肼除去胞嘧啶
4.1.3 自动化测序
以荧光化合物标记双脱氧核苷酸进行自动测序
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP
毛细管电泳
测序装置
a）一束并列的充 满凝胶的用于DNA 测序的毛细管 b）共聚焦荧光扫 描显微镜
芯片技术测序
利用基因芯片进行杂交测序的原理
4.2 DNA顺序的组装
鸟枪法（shotgun） 克隆重叠法 引导鸟枪法
4.2.1 随机测序与序列组装
流感嗜血杆菌（Haemorphilus influenzae）顺 序组装
1830kb（1995年，Fleischmann） 流程：
超声波将纯化的DNA随机打成2.0kb的片段 琼脂糖凝胶分离收集1.6~2.0kb片段 连接到质粒克隆载体，构建质粒文库 随机挑取19687个克隆，进行了28643次测序 可读顺序11,631,485bp，6×基因组 组装获得140个覆盖全基因组的顺序重叠群
上下颠倒，RT，20min 离心，Max，4500rpm，20℃，45分钟。温度不要低于
15℃，温度过低则容易使引物沉淀下来，影响测序结果 倒掉上清，去掉盖，翻转离心，700rpm，20℃，1min，然
后放在PCR仪上，打开盖，94.0℃，30sec 加入10μl 甲醛，混匀，94℃，6min。完成后，迅速置于冰
EST测序的优点
mRNA可直接反转录为cDNA，并很易构 建cDNA文库 只需一次cDNA测序即可获取EST的顺序 ，500 bp的cDNA序列足以鉴定所代表的 基因 不必反复检测EST顺序的准确性
浏览测序（sequence skimming）
粗略分析初步测序结果从中寻找基因编 码顺序的方法
基因组学课件基因组测 序与序列组装
2020年4月27日星期一
4.1 DNA测序的方法学
链终止法（The chain termination method） （Sanger，1977）
原理：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链 来读取待测DNA分子的顺序，合成的互补单链 可在不同位置随机终止反应
扩增，形成双链
双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增模板继续扩增反应
在反复进行30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆“DNA 簇群”
“DNA簇群”在Solexa测序仪上进行序列分析 测序反应：专利的“可逆性末端终结反应”，提高碱基合成来进行测序。四
种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应 只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去 ，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列
指导随机测序法的工作流程
4.2.3 指导测序与序列组装
4.3 基因组测序的其它路线
重要区域的优先测序 人类主要组织相 容性复合区 (human major histocompatibility complex, hMHC) 的测 序正是根据这一考虑率先完成的 EST测序 浏览测序
人类主要组织相容性复合区（MHC
洗去乳胶物质，使DNA变性，将带有单链DNA 的珠子加入到光学纤维玻片（fibre-optic slide）上
加入更小的带有焦磷酸盐测序所需酶的颗粒
a是光学纤维玻片装载的地方， 从ATGC瓶子来的溶液垂直流过开 放板面，进行PCR反应
b是电荷偶联装置（chargecoupled device, CCD，扫描仪一般 也采用这种原理成像）,负责捕获 每个孔发出的光子
样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵 敏精确地检测（1 ug DNA即可以进行末端双向测 序反应）
可以进行35碱基长度的末端双向测序反应
纳米孔道测序法——Nanopore
纳米孔道测序法 利用当单链DNA分子在外加电压下通过纳米
尺寸的孔道时产生的离子电流阻滞来测序 电流阻滞的调制显示出分子的长度、组成
PCR产生单链DNA
引物对 一侧连接小磁珠 吸磁提纯扩增
利用PCR 制备模板 DNA用于 链终止法 测序
不同类型的引物用于链终止法测序
热循环测序 优点：
1）作为模板的样 本可以是双链DNA 2）仅需微量的
DNA模板
PCR后处理
15μl反应液，加入60μl 75%异丙醇（45μl 异丙醇+15μl灭菌 水）
用鸟枪法完 成流感嗜血 杆菌基因组 测序
空隙（gap）
顺序间隙（sequence gap）
测序遗漏序列 相邻已知序列为探针筛选阳性克隆 99个遗漏间隙
物理间隙（physical gap）
建库丢失（载体或宿主选用不当） 新建文库：PCR或探针筛选 42→23
流感嗜血 杆菌基因 组完整顺
用于果蝇基因组鸟枪法测序的文库
载体 （kb) 高拷贝质粒 低拷贝质粒 BAC 总数
插入子长度 成对末端序列 测序的覆盖面
2
732 380
7.3 x
10
549 974
5.4 x
130 1 290
9 869 823
0.07x 12.8 x
鸟枪法的优势与局限
优点
速度快，无需提供相关的遗传图与物理图 生殖道支原体（Mycoplasma genitalium）
Solexa测序原理
Solexa技术特色
每张测序芯片有8个通道，每个通道可单独运行一 个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
一次实验可读取大于15亿个碱基/芯片 可精确读取重复序列，如：
AAAAAAAAAAAAAAAAA,TTTTTTTTTTTTT 实验费用低，测序成本为传统测序方法的1/100 无需建库，自动化样品制备，简单，成本低
由大肠肝菌DNA多聚酶I而来 5‘→3’酶切活性已被切除 合成长度250bp，缺乏单一性
测序酶（Sequenase）
由噬菌体T7编码的DNA多聚酶 有很高的加工效率 无外切核酸酶活性 能利用修饰的核苷酸作为底物
制备单链DNA的方法
将DNA克隆到质粒载体中
双链→碱或热变性为单链 2条互补单链，双向测序 缺点：未纯化的DNA污染
序的组装
4.2.1 随机测序与序列组装
果蝇基因组鸟枪法测序
180Mb，3对常染色体，1对性染色体 1/3为异染色质
果蝇测序策略
构建3个基因组文库
2kb：测序 10kb：覆盖重复序列-----contig 130kb：大范围序列组装-----Scaffold
末端测序
3 ×106个末端测序 2%来自于异色质DNA STS结合物理图筛选——95%区域 单一重叠群（U-contig）和支架：20Mb, 97.5%
、结构和动态行为
非常规DNA测序——DNA芯片测序
基本原理
将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有 指定的位置
待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交 的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后 根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对 比组装,拼接成完全的DNA顺序
以M13载体克隆单链DNA
M13复制产生单链，不用变性 只能用于小片段DNA，大片段容易丢失或重排
利用噬菌体M13制备单链DNA
制备单链DNA的方法
以噬粒（phagemid）克隆DNA
2个复制原点：质粒 & M13 噬粒和辅助噬菌体（helper phage） 克隆片段大于10kb
技术的多样性和灵活性
4.1.2 化学降解法
基本原理 在选定的核苷酸碱基中引入化 学基团再经化合物处理使DNA分子在被 修饰的核苷酸位置降解
图4.7 化学降解测序法
M-G法所用的化学修饰技术
碱基 G A+G
C+T C
特异修饰方法 pH 8.0，用硫酸二甲酯对N7进行甲基化，使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性 pH2.0，哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化，从 而导致脱嘌呤，并因此削弱腺嘌呤和鸟嘌呤的 糖苷键
）
位于第6号染色体，全长3.6 x 106 bp，与人类免 疫系统有关
诸如类风湿关节炎，牛皮藓等炎症以及从癌症到 阅读障碍等不同的疾病均与该区的遗传缺陷有关 （Beck，1999）
人类MHC区由224个基因座组成，其中有93个座 位（41.5%）是直接通过基因组测序发现的
人类MHC区是迄今为止已测序的人类基因组中基 因分布最密集的区域，平均每16 kb含一个基因， 也是多态性最丰富的区域，有些座位等位基因成 员超过200
化学降解法（Chemical degradation method ）（Maxam and Gilbert, 1977）
原理：双链DNA分子经化学试剂处理，可在特 定的核苷酸位点产生切口。用同位素标记测序 碱基，以此确定顺序组成
4.1.1 链终止法测序
技术要点 : 制备相同的单链模板DNA 加入少量的双脱氧核苷酸（ dideoxynucleotide，ddNTP）
技术路线与要求
制备单链模板 ↓
将单链模板与一小段引物退火 ↓
A 克隆于质粒中DNA→用碱或热变性 B M13克隆单链DNA（单链→ 双链→ 单链） C 噬粒克隆DNA (helper) →单链 D PCR产生单链DNA
加入DNA多聚酶 4种脱氧核苷酸
A 高聚合酶活性 B 5’→3´外切酶活性？ C 3´→5´外切酶活性？
c就是负责与人进行交互作用的 电脑装置
454生命科学公司
Watson血液样本，给DNA的老爸 做一份基因组图谱---100天
Solexa基本原理
基因组DNA被随机打断成为小的DNA片断；并在DNA片断的两端连上接头 (adapter)
Solexa测序专用的测序芯片（flow cell）表面连接有一层单链引物（Primer ）,单链状态的DNA片断与芯片表面的引物通过碱基互补被一端“锚定”在芯 片上
• 脱氧三磷酸核苷酸连接到 DNA 3’-末端时会释放1个焦 磷酸(PPi)
• 焦磷酸在磷酸化酶的作用下 转化为化学能,并发出光亮
• 往反应液中每次只加入1种 核苷酸,当加入的核苷酸结合 时,反应液发出亮点,并记录 核苷酸种类
• 当核苷酸未结合时,反应液中 的核苷酸酶迅速分解此核苷 酸,由此来测定DNA序列
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer
非常规DNA测序——光点测序
• 光点测序
通过扩增反应使得单链DNA成为双链DNA 双链再次变性后成为单链，其一端“锚定”在测序芯片上，另外一端（5’或
3’）随机和附近的另外一个引物互补，被“锚定”住，形成“桥“(bridge) 在测序芯片上同时有上千万DNA单分子发生以上的反应 4中形成的单链桥，以周围的引物为扩增引物，在测序芯片表面再次进行
分别加入少量4种双脱氧核苷酸 ↓
将4种反应产物分别在4条泳道电泳 ↓
ddATP/ddCTP/ddGTP/ ddTTP 的3’碳原子连接 的是氢原子,不是羟基
根据4个碱基在4条泳道的终止位置读出基因序列
图4.1
链终止 法测序
图4.2 用于测序的DNA多聚酶
用于测序的DNA多聚酶
Klenow多聚酶
特点 ：
一个典型的反应可以在4小时内测出2千5百 万个碱基，准确率可达到99％
SangБайду номын сангаасr毛细管电泳法测序平均每个小时可读 6万7千个碱基，平均准确率为99.4％
PCR反应：
随机切割基因组，将双链解旋，给单链的 DNA加上接头
每颗珠子带有自己特有的单一的DNA片段， 然后在倒入的含有PCR必需试剂的乳胶颗粒 中发生PCR反应，PCR在不同的地方终结使珠 子带有同一DNA模板的不同拷贝的DNA
590kb，5人8周
局限
大基因组，结构过于复杂，序列组装的起始阶 段工作量非常大
小重复顺序及其数量，在顺序组装时可能出现 错误连接
美国斯坦福大学：
Celera Genomics公司果蝇基因组注释，29%完全正确，26%基本正确，45%有严重错误
4.2.2 限定测序与序列组装
在一些已经绘制了遗传图与物理图的生 物基因组测序中，先进行各个克隆的随 机测序，再按照基因组物理图进行序列 组装，即重叠克隆群测序
肼可打开嘧啶环，后者重新环化成五元环后易 于除去 在1.5mol/L NaCl存在时，可用肼除去胞嘧啶
4.1.3 自动化测序
以荧光化合物标记双脱氧核苷酸进行自动测序
ddATP ddCTP ddTTP ddGTP
毛细管电泳
测序装置
a）一束并列的充 满凝胶的用于DNA 测序的毛细管 b）共聚焦荧光扫 描显微镜
芯片技术测序
利用基因芯片进行杂交测序的原理
4.2 DNA顺序的组装
鸟枪法（shotgun） 克隆重叠法 引导鸟枪法
4.2.1 随机测序与序列组装
流感嗜血杆菌（Haemorphilus influenzae）顺 序组装
1830kb（1995年，Fleischmann） 流程：
超声波将纯化的DNA随机打成2.0kb的片段 琼脂糖凝胶分离收集1.6~2.0kb片段 连接到质粒克隆载体，构建质粒文库 随机挑取19687个克隆，进行了28643次测序 可读顺序11,631,485bp，6×基因组 组装获得140个覆盖全基因组的顺序重叠群
上下颠倒，RT，20min 离心，Max，4500rpm，20℃，45分钟。温度不要低于
15℃，温度过低则容易使引物沉淀下来，影响测序结果 倒掉上清，去掉盖，翻转离心，700rpm，20℃，1min，然
后放在PCR仪上，打开盖，94.0℃，30sec 加入10μl 甲醛，混匀，94℃，6min。完成后，迅速置于冰
EST测序的优点
mRNA可直接反转录为cDNA，并很易构 建cDNA文库 只需一次cDNA测序即可获取EST的顺序 ，500 bp的cDNA序列足以鉴定所代表的 基因 不必反复检测EST顺序的准确性
浏览测序（sequence skimming）
粗略分析初步测序结果从中寻找基因编 码顺序的方法
基因组学课件基因组测 序与序列组装
2020年4月27日星期一
4.1 DNA测序的方法学
链终止法（The chain termination method） （Sanger，1977）
原理：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链 来读取待测DNA分子的顺序，合成的互补单链 可在不同位置随机终止反应
扩增，形成双链
双链经变性成单链，再次形成桥，成为下一轮扩增模板继续扩增反应
在反复进行30轮扩增，每个单分子得到了1000倍扩增，成为单克隆“DNA 簇群”
“DNA簇群”在Solexa测序仪上进行序列分析 测序反应：专利的“可逆性末端终结反应”，提高碱基合成来进行测序。四
种碱基分别标记四种不同荧光，每个碱基末端被保护基团封闭，单次反应 只能加入一个碱基，经过扫描，读取该次反应颜色后，该保护基团被除去 ，下一个反应可继续进行，如此反复，得出碱基的精确序列
指导随机测序法的工作流程
4.2.3 指导测序与序列组装
4.3 基因组测序的其它路线
重要区域的优先测序 人类主要组织相 容性复合区 (human major histocompatibility complex, hMHC) 的测 序正是根据这一考虑率先完成的 EST测序 浏览测序
人类主要组织相容性复合区（MHC
洗去乳胶物质，使DNA变性，将带有单链DNA 的珠子加入到光学纤维玻片（fibre-optic slide）上
加入更小的带有焦磷酸盐测序所需酶的颗粒
a是光学纤维玻片装载的地方， 从ATGC瓶子来的溶液垂直流过开 放板面，进行PCR反应
b是电荷偶联装置（chargecoupled device, CCD，扫描仪一般 也采用这种原理成像）,负责捕获 每个孔发出的光子
样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵 敏精确地检测（1 ug DNA即可以进行末端双向测 序反应）
可以进行35碱基长度的末端双向测序反应
纳米孔道测序法——Nanopore
纳米孔道测序法 利用当单链DNA分子在外加电压下通过纳米
尺寸的孔道时产生的离子电流阻滞来测序 电流阻滞的调制显示出分子的长度、组成
PCR产生单链DNA
引物对 一侧连接小磁珠 吸磁提纯扩增
利用PCR 制备模板 DNA用于 链终止法 测序
不同类型的引物用于链终止法测序
热循环测序 优点：
1）作为模板的样 本可以是双链DNA 2）仅需微量的
DNA模板
PCR后处理
15μl反应液，加入60μl 75%异丙醇（45μl 异丙醇+15μl灭菌 水）
用鸟枪法完 成流感嗜血 杆菌基因组 测序
空隙（gap）
顺序间隙（sequence gap）
测序遗漏序列 相邻已知序列为探针筛选阳性克隆 99个遗漏间隙
物理间隙（physical gap）
建库丢失（载体或宿主选用不当） 新建文库：PCR或探针筛选 42→23
流感嗜血 杆菌基因 组完整顺
用于果蝇基因组鸟枪法测序的文库
载体 （kb) 高拷贝质粒 低拷贝质粒 BAC 总数
插入子长度 成对末端序列 测序的覆盖面
2
732 380
7.3 x
10
549 974
5.4 x
130 1 290
9 869 823
0.07x 12.8 x
鸟枪法的优势与局限
优点
速度快，无需提供相关的遗传图与物理图 生殖道支原体（Mycoplasma genitalium）
Solexa测序原理
Solexa技术特色
每张测序芯片有8个通道，每个通道可单独运行一 个样品，也可以把多个样品混合在一起检测；
一次实验可读取大于15亿个碱基/芯片 可精确读取重复序列，如：
AAAAAAAAAAAAAAAAA,TTTTTTTTTTTTT 实验费用低，测序成本为传统测序方法的1/100 无需建库，自动化样品制备，简单，成本低
由大肠肝菌DNA多聚酶I而来 5‘→3’酶切活性已被切除 合成长度250bp，缺乏单一性
测序酶（Sequenase）
由噬菌体T7编码的DNA多聚酶 有很高的加工效率 无外切核酸酶活性 能利用修饰的核苷酸作为底物
制备单链DNA的方法
将DNA克隆到质粒载体中
双链→碱或热变性为单链 2条互补单链，双向测序 缺点：未纯化的DNA污染
序的组装
4.2.1 随机测序与序列组装
果蝇基因组鸟枪法测序
180Mb，3对常染色体，1对性染色体 1/3为异染色质
果蝇测序策略
构建3个基因组文库
2kb：测序 10kb：覆盖重复序列-----contig 130kb：大范围序列组装-----Scaffold
末端测序
3 ×106个末端测序 2%来自于异色质DNA STS结合物理图筛选——95%区域 单一重叠群（U-contig）和支架：20Mb, 97.5%
、结构和动态行为
非常规DNA测序——DNA芯片测序
基本原理
将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有 指定的位置
待检测的DNA分子与芯片温浴,凡是能杂交 的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后 根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对 比组装,拼接成完全的DNA顺序
以M13载体克隆单链DNA
M13复制产生单链，不用变性 只能用于小片段DNA，大片段容易丢失或重排
利用噬菌体M13制备单链DNA
制备单链DNA的方法
以噬粒（phagemid）克隆DNA
2个复制原点：质粒 & M13 噬粒和辅助噬菌体（helper phage） 克隆片段大于10kb