草莓品种宁玉组织培养技术研究与应用

摘要
摘 要：草莓苗的生产主要依靠无性繁殖技术，并且常规生产的过程中易感染病毒。因病毒感染而导致种性退化、减产，让草莓的品质与产量严重下降。用农药对病毒进行防治效果甚微，且会造成严重农药污染。因此，利用组织培养技术获得大量脱毒苗是解决此问题的有效途径。本实验以当年生‘宁玉’草莓的匍匐茎做为试验材料，进行消毒灭菌后，通过茎尖诱导分化、继代增殖、生根培养等过程中，对培养基内植物激素进行浓度的改变，来筛选出各个阶段的最适培养基配方。结果表明：适宜诱导分化的培养基配方为MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.3mg/L；增殖继代培养基配方为MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L；生根培养基配方为1/2MS+NAA 0.06mg/L或1/2MS+IBA 0.04mg/L，生根率普遍可达96.6%。
关键词：组培草莓 宁玉 脱毒苗 快繁技术
　
ABSTRACT
ABSTRACT：Strawberry Plantlets rely mainly on asexual propagation technology, and are susceptible to viruses during routine production. Due to virus infection, the quality and yield of strawberries are seriously reduced due to virus degeneration and ing tissue culture technology to obtain a large number of virus-free seedlings is an effective way to solve this problem. In this experiment, the stolons of the "Ningyu" strawberry were used as experimental materials. After disinfection and sterilization, the concentrations of Phytohormones in the medium were changed through the differentiation, subculture and rooting culture.The optimum medium formula for each stage was screened out. The results showed that: the suitable medium for inducing differentiation was MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.3mg/L; the proliferation subculture medium was MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L; the rooting medium formula was 1/2MS+NAA 0.06mg/L or 1/2MS +IBA0.04mg/L; and the rooting rate was generally up to 5%.
KEYWORD：tissue culture,　Ningyu;　virus-free seedling;　strawberry rapid propagation
目录
引言 1
1 文献综述 2
1.1 草莓概述 2
1.1.1 草莓的形态特征 2
1.1.2 草莓的生长习性 2
1.1.3 草莓的经济价值 2
1.2 草莓组织培养研究进展 2
1.2.1 茎尖培养 2
1.2.2 叶片培养 3
1.2.3 花药培养 3
1.2.4 原生质体培养 3
1.3 研究的目的和意义 4
2 诱导分化培养 5
2.1 材料与方法 5
2.1.1 试验材料 5
2.1.2 试验方法 5
2.2 结果与分析 6
2.3 结论与讨论 7
3 继代培养 8
3.1 材料与方法 8
3.1.1 试验材料 8
3.1.2 试验方法 8
3.2 结果与分析 8
3.3 结论与讨论 9
4 生根培养 10
4.1 材料与方法 10
4.1.1 试验材料 10
4.1.2 试验方法 10
4.2 结果与分析 10
4.3 结论与讨论 11
4.4 组培苗驯化移栽 11
5 组织培养技术应用 12
5.1 植物育种 12
5.2 植物脱毒 12
5.3 种质资源保存 12
6 结论 13
6.1 初代培养 13
6.2 继代培养 13
6.3 生根培养 13
谢辞 14
参考文献 15
引言
草莓（Frag

aria ananassa）是蔷薇科草莓属多年生草本植物，是广泛分布在世界上的浆果类果树。
草莓柔软多汁，色彩艳丽，营养丰富，含有多种微量元素，如钙、磷、铁、钠、钾等；其中钙是人类骨骼的重要组成元素[1]。草莓中还富含维生素C和多种氨基酸，如苏氨酸、丝氨酸、甘氨酸、亮氨酸、赖氨酸等，微量元素钙、镁与维生素C的协同作用可以保证人类血管的弹性，促进血液的循环流通[2]。草莓果实不仅有鲜食这一种食用途径，同时还可制成草莓汁、草莓酒、果酱、果干、果脯等多种加工食品，也可作为冰淇淋、蛋糕的装饰添加物，具有很高的市场价值[3]。
在我国，大部分设施栽培草莓都会受草莓斑驳病毒、草莓轻型黄边病毒、草莓镶脉病毒和草莓皱缩病毒侵染，侵染株率达80.2%[4]。然而在生产草莓苗过程中，农户主要是通过母株的匍匐茎进行无性繁殖，这种无性繁殖多年后就会造成病毒在植株体内的逐渐累积，致使草莓叶子皱缩，生长缓慢，品种特性日益退化，口感和质量不断降低，销量和产量逐年减少。在我国，常规繁殖生产出的草莓种苗，病毒感染率每年可达到20%～30%，致使产量降低20%到50%[5]。因此，利用组织培养技术获得大量脱毒苗是解决此问题的有效途径，对优良品种的性状保持和产量稳定也有重要作用。
‘宁玉’是江苏省农业科学院园艺研究所2005年以幸香草莓为母本，以章姬草莓为父本通过杂交育种获得的优质草莓新品种。该品种株型适中，果实早熟，果大，整齐，色泽艳丽，品质优，产量高，耐贮运，植株抗病虫能力和适应性强，已在江苏、安徽、浙江、上海、山东等省区栽培应用[6]。
1文献综述
1.1草莓概述
1.1.1草莓的形态特征
草莓是蔷薇科草莓属多年生草本植物，园艺学属浆果类水果，株高12.0～40.0cm，草莓叶片三叶，呈绿色，椭圆形，边缘有钝锯齿，背面有少量白色绒毛；花序呈聚伞花序状，花分雌雄性，花型小巧，花色白色或红色[7]。
1.1.2草莓的生长习性
草莓喜光耐阴，光照越强，植株长势越好。草莓生长的合适温度为18～25℃，夜间最低为12℃。种植草莓的土壤要有足够的有机肥，为草莓生长提供氮、磷、钾、钙等必要的营养元素。
1.1.3草莓的经济价值
据联合国粮农组织数据库信息可知，我国是草莓生产大国。国内对草莓的需求量很大，除鲜果消费外，草莓冰淇淋、草莓果酱、草莓果干等加工食品日益受到广大消费者的喜爱。草莓产业的迅速发展，促进了当地的产品包装、物流、商品贸易等相关产业飞速发展，增加了就业岗位，促进了经济增长。同时，利用草莓与其他水果植物进行套作，例如“草莓－葡萄”

、“草莓－甜瓜”等种植方式，充分合理的利用土地，从而获得多种经济效益，为果农提供更多经济收入[8]。
1.2草莓组织培养研究进展
1.2.1茎尖培养
茎尖培养是目前最为常见的草莓组织培养方法，主要是利用草莓茎尖的分生能力，在组培条件下，短时间内获得大量无菌草莓种苗。
草莓匍匐茎茎尖大小会对茎尖培养的成活概率造成影响。何欢乐[9]等研究发现，在相同养条件下剥离茎尖越大，诱导成活率越高，即茎尖大小和成活率呈正比关系。每个草莓品种都最适适宜的培养基和激素浓度，因为不同品种草莓基因型也不同，培养基对其茎尖分化诱导的影响也不同[10]。在对草莓各个品种进行茎尖培育时，应选择与其适合的激素种类和浓度。
1.2.2叶片培养
草莓叶片离体培养是在叶片伤口部位进行脱分化从而形成愈伤组织，再通过愈伤组织再分化，增殖形成不定芽的过程。使用叶片作为外植体优点是取材方式便利, 同时能较好的保持植株的遗传性状[11]。影响草莓叶片离体再生的因素有很多，与基因型有关，也和着生叶的部位、叶龄、植物生长调节剂配比等有关[12]。于冬梅[13]等以多种草莓叶片为试材，研究草莓基因型对叶片不定芽诱导的影响。结果表明，在叶龄一致的前提下，在MS+TDZ 0.5mg/L+IAA 0.5mg/L培养基上，品种“M14”诱导率高达95.24%，而“明磊”诱导率低为14.29%，说明不同基因型对叶片不定芽的诱导分化也不同。王翡等以草莓品种“明宝”和“红颊”叶片为外植体，研究叶龄对叶片再生不定芽的影响。得出“明宝”30～40d叶龄的叶片分化率最高，不定芽的再生率为82.8%，“红颊”10～20 d叶龄的叶片分化率最高，不定芽再生率为79.8%[14]，说明各个品种草莓的分化对叶片的叶龄要求各不相同。
1.2.3花药培养
草莓花药培养也可培养出无菌脱毒苗，优点是步骤简单，易消毒，繁殖容易。培养所获得的单倍体植株，是研究遗传规律的好试材。单倍体对于突变的检测和抗性细胞系的筛选很有利，可大大缩短育种年限[15]。
覃兰英[16]等通过花药愈伤组织获得再生植株，培育出春香、宝交早生等多品种的花药脱毒苗，出苗率在50%以上。薛光荣[17]等通过花药培养获得了沙尔普斯、红岗利得、宝生、春香、索非亚共5个品种的再生植株,脱毒率达100% 。
1.2.4原生质体培养
原生质体是没有细胞壁的“裸露细胞”。原生质体培养是新兴的细胞工程技术，主要是通过对体细胞进行遗传转化融合，选育出性状优良的品种。草莓大量的野生资源和染色体多倍性等特性，使得原生质体培养成为草莓育种的一项重要技术方式。原生质体可以摄取外源细胞器、病毒、DNA等各种

大分子遗传物质，是进行遗传转化的理想工具。原生质体的材料多为叶肉细胞、愈伤组织、悬浮培养液。康洁[18]用“丰香”、“红颜”草莓的愈伤组织、嫩叶、嫩茎为试材,采用酶解细胞壁提取原生质体和聚乙二醇(PEG)促细胞融合的方法，对草莓原生质体提取的最佳材料进行研究。结果表明：“丰香”、“红颜”这两个品种草莓提取原生质体的最佳材料都为嫩叶。目前草莓上关于原生质体融合技术的相关报道仍不多，还有待于进一步探索。
1.3研究的目的和意义
传统的草莓苗繁殖技术会使草莓的单位产量低，病毒在植株体内逐渐积累，影响草莓的产量和品质。组织培养具备用时周期短、高效的优点，不被时令变化所影响，具有可控性，可以在较短时间内繁殖出大量种苗。在过去几十年里，对于草莓的组织培养研究已有丰硕的成果，但对草莓品种宁玉在组织培养过程中各阶段的植物激素的适宜配比浓度研究不多，缺乏对组织培养生产育苗提供相关技术参数。故关于宁玉草莓组培快繁研究还需探索和完善。
本试验以草莓品种‘宁玉’茎尖作为外植体进行离体培养，通过茎尖诱导分化、继代增殖培养、生根培养等阶段，对培养基内植物激素进行浓度的改变，来筛选出各个阶段的最适培养基配方。完善宁玉草莓组培快繁技术，为草莓品种的推广使用和脱毒苗进行规模化生产提供参考，为种质资源的保存奠定基础。
2诱导分化培养
2.1材料与方法
2.1.1试验材料
外植体材料：当年生宁玉草莓健康幼嫩匍匐茎的茎尖。
试剂选择：MS培养基、琼脂、蔗糖、无菌水、75%乙醇、0.1%升汞。
2.1.2试验方法
2.1.2.1外植体的灭菌处理
将采回来的匍匐茎保留茎尖3cm，用流水冲洗1.5h，在超净工作台内，使其充分浸入75%的乙醇20s后，使用无菌水反复冲洗5次，再用0.1%的升汞浸泡7min，用无菌水反复冲洗5次。利用镊子和解剖刀，切取茎尖生长点0.3mm，将处理好的茎尖装入不同培养基内，观察其生长状态。
2.1.2.2诱导产生不定芽
以MS培养基作为基础培养基，选择配比不同的6-BA、NAA和IBA，筛选出在诱导分化阶段最适宜的培养基配方。将剥离好的草莓茎尖接种于培养基上，仔细观察并记录分生组织的动态，20d后统计茎尖萌芽率。本试验共设计九种培养基配比方案，分别为：
A1培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA 0.1mg/L；
A2培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.3mg/L；
A3培养基：MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.3mg/L+IBA 0.2mg/L；
A4培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA 0.3mg/L；
A5培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.2mg/L；
A6培养基：MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.3mg/L+IBA 0.1mg/L；
A7培养基：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.1mg/L+IBA 0.2mg/L；
A8培养基

：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+IBA 0.1mg/L；
A9培养基：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.3mg/L+IBA 0.3mg/L。
萌芽率（%）=萌芽数/外植体总接种数×100%
2.1.2.3培养条件
pH调至5.8；琼脂7g/L；蔗糖30g/L；培养基40mL/瓶；一瓶接种5个茎尖，每6瓶一个处理组。培养室温度25℃，光照强度2000-3000Lux，观察并记录生长状况。
2.2结果与分析
观察研究发现，接种一周后，草莓茎尖生长状态分为以下三种：不萌发；芽逐渐发生褐化；正常萌发，基部形成愈伤组织，20d后茎尖直接分化成小苗。
表2-2 植物激素不同浓度配比对茎尖分化的影响
处理 6-BA（mg/L） NAA（mg/L） IBA （mg/L） 外植体（个） 萌芽数（个） 萌芽率 （%）
A1 0.5 0.1 0.2 30 27 90
A2 0.5 0.2 0.1 30 24 80
A3 0.5 0.3 0.3 30 16 54
A4 1.0 0.1 0.3 30 23 76
A5 1.0 0.2 0.2 30 21 70
A6 1.0 0.3 0.1 30 19 66
A7 2.0 0.1 0.2 30 18 62
A8 2.0 0.2 0.1 30 17 56
A9 2.0 0.3 0.3 30 15 50
表2-2结果表明，各组处理都可以诱导茎尖直接成芽，在组培条件下，对宁玉草莓不定芽诱导发挥作用最好的组合为A1，萌发率达90%，组合为:6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+IBA0.2mg/L。在6-BA浓度为0.5mg/L的处理组里， 随着NAA、IBA的浓度增加，发芽率有上升又逐渐降低的趋势，说明NAA与IBA浓度适当的情况下，对茎尖诱导有良好的促进作用。同时从表2-2可看出，当6-BA浓度为2.0mg/L时，萌发率低于浓度为0.5mg/L和1.0mg/L的处理组。随着6-BA浓度的上升，萌发率逐渐降低，说明6-BA 浓度过高反而会影响茎尖的成活与生长。
2.3结论与讨论
植物激素在组培过程中，种类和浓度都对植物成活与生长有重要的影响。本次试验结果表明，最适宁玉草莓的初代培养基为：MS+6BA0.5mg/L+NAA 0.1mg/L +IBA 0.2mg/L，萌发率为90%。在不定芽诱导试验中，6-BA起主导作用，随着6-BA浓度的升高，萌发率逐渐下降，6-BA浓度过高会影响茎尖的成活与生长；NAA与IBA在浓度适当的情况下有良好的促进作用；三者合理搭配，可达到最佳诱导效果。
3继代培养
3.1材料与方法
3.1.1试验材料
以宁玉草莓诱导分化阶段繁育出的不定芽作为试验材料。
3.1.2试验方法
将诱导分化阶段长出的小苗接种到增殖培养基上，每瓶共接种5株，每个处理组6瓶。配置激素含量不同的MS培养基，设置浓度梯度，30d后观察统计数据。本试验共设计九种继代培养基配比方案，分别为：
B1培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L；
B2培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L；
B3培养基：MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L；
B4培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L；
B5培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.2mg/L；
B6培养基：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L；
B7培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.1mg/L；
B8培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L；
B9培养基：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.3mg/L。
增殖系数=增殖后的有效苗株数/接种的苗株