哺乳动物的精子获能及其鉴定

的培养条件下进行。
液（如输卵管液、滤泡液和血清等），而这些体液的成
1 精子获能的方法
分相对复杂，很难确定何种成分诱发或支持精子获
精子获能的方法分为体内获能和体外获能两种。 能。自从 Toyoda 等最先报道了采用一种特定的化学
1.1 体内获能
培养基获得体外受精成功以来，分析体外精子获能
早期的获能研究，采用体内获能的方法，即从交 已成为比较容易的事情[5]。以 Tyrode、KRB、HamF10、
摘 要：精子获能是精卵结合的前提，是哺乳动物受精过程中的关键环节。精子获能的发现促使体
外授精研究取得了突破性进展，为人类研究受精机理奠定了基础。本文从体内、体外两方面论述了
哺乳动物精子获能的培养方法，并且对精子获能的评价方法进行了综述。
关键词：精子获能；培养；评价
中图分类号：S814
文献标识码：B
文章编号：1005-2739（2010）02-0001-03
殖道内，而且可以在异种动物生殖道内或液体内进 等，其精子体外获能的研究越来越多。近年来的研究
行获能。将牛精子放入家兔子宫和猪输卵管内培养 表明，体外获能发展起来的实验手段几乎可以达到
同样能使精子获能[4]。精子在成熟过程中，表面被覆 与体内获能相同的效果，这就使得体外获能的研究
了蛋白质类和多胺类，这些物质的存在对获能具有 可以揭示体内获能的本质[6]。精子体外获能技术可以
反应[3]。目前，诱导精子体外获能的方法主要有上浮 法、沉淀加上游法和不连续密度梯度法。
经上浮法处理可获得活力较强的精子，但精子
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黑龙江动物繁殖 第 18 卷 第 2 期 2010 年
回收率较低，目前该方法已成为牛精子 （尤其是冻 剧 地 前 向 运 动 （或 穿 梭 运 动） 和 鞭 打 样 运 动 [3]。
精子一旦获能，其运动类型即发生显著改变，精 AR 型。“F”型为未获能精子，其顶体帽完整，整个顶
子头部侧摆幅度和频率明显增加，尾部振幅加大，频 体布满黄绿色荧光；“B”型精子为已获能精子，其特
率加快，呈现一种特殊的超激活运动或鞭打样运动。 点是顶体帽仍然存在，但在顶体后区出现一条暗淡
它是精子为适应受精而形成的一种特殊的运动类 的荧光区带；“AR”型精子，顶体帽缺，如整个精子头 型，所反映的是精子运动能力和方式的改变。其特点 部显示淡绿色或无荧光，即为完成顶体反应的精子。
江峰根据所使用人精液的质量，将其处理方法分为 的了解[9]。
7 种：（l）少精子症，离心后再重悬于较小体积营养液 2.2 顶体反应
中；（2）弱精子症，离心 - 上游技术结合添加咖啡因
顶体反应是精子在获能过程中的生理变化和形
或血管舒缓素；（3）畸形精子，牛血清白蛋白（BSA）、 态学变化，是哺乳动物的精子具备受精能力的必要
和 Percoll 密度梯度离心；（7）逆行射精，洗涤加上游 双层顶体外膜多位点自我融合而成[10]。虽然顶体反
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处理[7]。
应是获能的终点，但获能过程本身还存在着不同阶
2 获能评价的方法
段，需要采用相应的判断指标。随着细胞生物学、分
精子获能是一系列的生理生化反应过程，其步 子生物学和免疫学以及显微镜技术的发展，许多检
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人血清白蛋白或牛宫颈黏液滤过、Percoll 密度梯度 条件。早期的研究者认为，顶体反应是由精子质膜和
离心；（4）液化不全，玻璃纤维过滤；（5）黏度过高， 顶体外膜相互融合，形成囊泡化，使顶体内含物逸出
淀粉酶处理、密度梯度离心等；（6）杂质过多，上游法 顶体。陈大元等认为质膜并不参与顶体囊泡化，而是
霉素与活体荧光染料 H33258 对活精子进行双色染 极化，胞内 pH 升高，Ca2+ 和 cAMP 含量增加，超氧阴
色用于观察整个体外受精获能和顶体反应过程中顶 离子生成量增多，以及特异蛋白质的酪氨酸磷酸化
体的变化[12]。
增强等现象进行了研究。而由于精子获能的分子机
2.3 精子穿卵试验
制相当复杂，且受到多种细胞信号途径的调控，目前
子的受精能力和体外获能效果。而去除透明带的金 黄地鼠卵子对获能精子没有种间特异性，即能够接 受同种或异种动物获能精子的穿入。将去除透明带 的金黄地鼠卵子与经过获能处理的精子一起孵育一 段时间后，以有膨大的精子头部或有雌雄原核并有 精子尾部判断为获能精子穿入[15]。它为筛选避孕药
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的精子获能评价方法为精子超激活运动、顶体反应 记法等[11]。
和精子穿卵试验（sperm penetration test，SPA）。此外
近年来，金霉素荧光染色法技术越来越受到人
还有去能因子鉴定法、测定精子呼吸能等方法。
们的重视，它是根据精子不同获能状态进行染色，并
2.1 超激活运动
可将精子分为 3 种 CTC 荧光染色类型，即 F、B 和
ZHUANLUN ZONGSHU
专论 综述
Heilongjiang Journal of Animal Reproduction Vol．18 No．2 2010
哺乳动物的精子获能及其鉴定
张士芳 1，2
（1.东北林业大学 野生动物资源学院，黑龙江 哈尔滨 150040；2.黑龙江省科学院自然与生态研究所 150040）
历的一个生理阶段。自然情况下，精子获能是在雌性 难控制，因而给研究精子获能带来极大的困难。为
生殖道内进行，自宫颈开始，经历子宫和输卵管，最 此，体外获能的研究方法应运而生[3]。
后完成于输卵管壶腹部[2]。研究表明，精子获能不仅 1.2 体外获能
可以在雌性动物生殖道内进行，也可以在体外适当
早期研究精子体外获能通常使用各种动物的体
抑制作用。在体内获能期间，精子在雌性生殖道内运 较好地控制实验条件，并可逐个分析获能的相关因
动时，子宫颈黏液、输卵管液和卵泡液，以及输卵管 子，极大地促进了精子获能的研究。
上皮细胞等，都有助于清除精子表面的抑制因子，促
精子体外获能总体包括两个步骤：一是精液的
进获能的发生。由于体内获能的研究，经常受到许多 处理，目的是减少或去除精浆内前列腺素、免疫活性
较高；不连续密度梯度法是近年用于分离精子的良 卵管峡部，克服输卵管上皮细胞的阻力，最后穿过卵
好方法，密度梯度离心法原理是形态正常精子的密 丘细胞及其细胞外基质和透明带起着重要的作用[8]。
度要高于异常的精子，经平衡离心后得到高受精力
目前，观察精子超激活运动的应用技术有：显微
的正常精子，该法适用于精子数量正常而活力较差 录像技术、连续分步曝光技术和计算机辅助精子分
的精液。若与精子上浮技术相结合，不连续密度梯度 析（CASA）技术等。CASA 分析系统在临床研究时备
法可获得更高质量的精子[6]。
受青睐，它可达到客观准确地量化精子运动情况，通
精子的质量不同，获能所使用的处理方法也不 过对精子头部运动轨迹摆动图形的分析，可获得精
同，要根据精子的来源及质量选择相应的处理方法。 子运动的多项参数，使人们对精子运动有更深层次
骤 分 为 ：（1） 超 激 活 运 动 （hyperactivated motility， 测精子顶体反应的技术相继建立，如普通光镜中的
HAM）：精子鞭毛运动的频率及类型发生改变；（2）获 三色染色法（TST）和考马斯亮蓝染色法（CBB），电子
能：精子膜结构及特征的精细改变；（3） 顶体反应 显微镜检查法（TEM）、荧光显微技术中的金霉素荧
人及哺乳动物的精子在离开生殖道时，还不能 特别是输卵管内回收到的精子数量太少，测定获能
立即与卵子受精，它必须经历一系列生理、生化及形 精子化学成分的改变更加困难；并且，精子在体内总
态的变化才能获得受精能力，这种生理现象称之为 是与雌性生殖道分泌物接触，而雌性生殖道中存在
获能（capacitation）[1]。精子获能是精子受精前必须经 着影响获能的因子，对于复杂的体内环境人们又很
精）洗涤与体外获能的主要方法；精子沉淀加上游法 Yanagimachi 于 1970 年首先在仓鼠精子获能时观察
适用于精子活力尚可或含有大量白细胞及碎片的精 到这种现象。Wang 等报道，人精子超激活运动的发生
液，此方法有利于分离活动精子与死精子，且回收率 率与体外受精率呈高度相关性，并且对于精子穿越输
配母畜的子宫内取出精子用于受精，以受精率为指 BSA、BWW、BO 等培养液进行哺乳动物精子获能培 标，分析获能的部位、时程及其机制[3]。进一步研究发 养均见报道。目前，常用的为 BO 液和改良的 Tyrdoe
现，获能过程没有种的特异性，即精子不仅在同种生 液（TALP）两大类。许多哺乳动物，如鼠、牛、猴、马
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是头部运行轨迹呈不规律的“8”字形，并显著地偏离 目前此法已广泛应用在小鼠、牛、猪、猴和狗等哺乳
直线。精子的超激活运动一般存在两种运动类型：急 动物和人顶体反应机理研究中。并且 Hewitt 等将金
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Heilongjiang Journal of Animal Reproduction Vol．18 No．2 2010
物和评价避孕药物的效果及作用提供了新的方法。
hyperactivation and acrosome reaction and their relationships
精子异种穿卵法在人、鼠、牛等动物精子受精能力的 检测中均取得了比较好的效果[16]。 2.4 其他方法
去能因子鉴定法和测定精子呼吸能法也是精子 获能的鉴定方法。
条件的限制，在机体生殖道内培养需时间，其环境也 细胞、细菌和碎片，减少精液的黏稠度，以促进精子
受卵巢激素影响，不稳定因素多，且雌性生殖道内， 获能；二是使用某些特定成分诱导精子获能和顶体
收稿日期：2009- 11- 27 基金项目：黑龙江省科学院青年创新基金。 作者简介：张士芳（1981-），女，硕士研究生，研究实习员。
精子穿卵实验是临床上应用最广泛的评价精子 尚未明确，有待进一步研究。
受精能力的重要方法。它不仅可提供精子获能和顶 4 参考文献
体反应的状况，而且还可以了解精子与卵膜的融合 和精核的解聚能力。精子穿卵试验最早由 Yanagimachi 等报道[13]，后经过简化、改良，并进一步 标准化，使之适合于临床应用[14，15]。穿卵试验分为异 种穿卵试验和同种穿卵试验。异种穿卵试验主要利 用仓鼠卵子和金黄地鼠卵子进行精子获能鉴定。仓 鼠卵异种精子体外穿透试验，通过检测经各种方法 处理后的复苏冻精或鲜精精子的穿卵率，来评价精
（Arcosomal reaction，AR）：标志着精子获能已经完 光染色法 （Chlortetracycline，CTC）、Hoechst33258 结
成。根据获能精子在运动、形态及代谢等方面的变化 合的植物凝集素标记法、顶体酶释放测定法、单克隆
特征，创立了多种精子获能的评价方法。目前，常用 抗体间接免疫荧光法和豌豆凝集素 （FITC- PSA）标