细菌内毒素检查结果准确性的影响因素
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影响:
影响酶原的激活；
影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的 活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构 使其变性失活。
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22
故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶 细菌内毒素工作标准品。
③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可 按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后 分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次 性使用。
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4） 错误使用
有部分客户使用厂家生产的细菌内毒素来复核 鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚 者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核鲎试 剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。
细菌内毒素检查结果准确性的 影响因素
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1
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响 实验器皿的的影响 样品成份及理化性质的影响 实验员的影响 环境的影响
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1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
➢鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性； ➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
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如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
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2） 器皿的正确处理
2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水 分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用 自来水将残余的洗液洗净，再用蒸
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馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置 烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒 素。”
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3） 金属离子和弱酸阴离子
离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面 阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造 成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离 子（如Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作 用；重金属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性 而使酶失活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、 Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因 PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、 Mg2+离子，使实验呈假阴性。
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4 样品成份及理化性质的影响
β-葡聚糖样物质的影响 PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
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1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
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2） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿 必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客 户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿， 结果试验中所有的阳性对
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照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较 大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造 成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤 不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂 酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准 确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作 规程，用多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？ 标示值是否准确？
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2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差 细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
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1） 细菌内毒素标准品种类 ➢细菌内毒素国际标准品 ➢细菌内毒素国家标准品 ➢细菌内毒素工作标准品
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6
3） 内毒素标准品操作误差
正确 （易折点）错误
取细菌内毒素工作标准一支， 轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底， 再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 用75%酒精棉球擦拭后启开 ， 防止玻璃屑落入瓶内。
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7
注意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素， 不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在 封口膜上。
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目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的 物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲 线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点 的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其 它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
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鲎试剂反应机理图
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判断假阳性的方法： 1、特异性鲎试剂法； 2、定量反应曲线分析法； 3、家兔模拟试验法。
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2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。
相 对
7.0
活
鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH 力
在6.5-8.0；pH ≤3 或≥10时，
酶活性受到抑制。
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3 实验器皿的影响
器皿的计量管理（校正） 器皿的选择标准 器皿的正确处理
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1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或 吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内 毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离 子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。
影响酶原的激活；
影响酶分子的构象，过高过低的PH会改变酶的 活性中心的构象，或甚至改变整个酶分子的机构 使其变性失活。
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故鲎试验时，供试品 pH 最好应预调和6.58.0 为好，必要时可用无内毒素的 HCl 或NaOH 稀 溶液调节 pH 值。美国、日本药局方以及中国药典 故2005版规定检品必须调节PH值6.0-8.0。
②只能取1ml的细菌内毒素检查用水复溶 细菌内毒素工作标准品。
③若使用的为细菌内毒素国家标准品，可 按其使用说明书中的方法将其稀释至规定浓度后 分装保存。若为细菌内毒素工作标准品，为一次 性使用。
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4） 错误使用
有部分客户使用厂家生产的细菌内毒素来复核 鲎试剂的灵敏度，这是一种错误行为，更有甚 者使用厂家生产的细菌内毒素来交叉复核鲎试 剂的灵敏度，这是一种严重错误行为。
细菌内毒素检查结果准确性的 影响因素
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1
一、试验误差分析及改进措施
鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响 细菌内毒素工作标准品效价及使用的影响 实验器皿的的影响 样品成份及理化性质的影响 实验员的影响 环境的影响
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1 鲎试剂质量及灵敏度标示值得的影响
➢鲎试剂的质量：抗干扰能力，稳定性； ➢鲎试剂灵敏度标示值的准确性 。
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如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
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2） 器皿的正确处理
2005年版《中国药品检验标准操作规范》278页— —细菌内毒素检查法“实验准备”规定：“将被 洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水 分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用 自来水将残余的洗液洗净，再用蒸
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馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置 烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒 素。”
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3） 金属离子和弱酸阴离子
离子对细菌内毒素测定结果影响较大，一方面 阳离子如Fe3+、Al3+强度较大会引起内毒素的聚集造 成内毒素局部浓度过高，同时还必须注意高价阳离 子（如Fe3+）的氧化性对鲎试剂酶反应具有强抑制作 用；重金属离子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白质变性 而使酶失活；另一方面鲎试剂必须在二价阳离子Ca2+、 Mg2+的参与下才能被激活形成凝胶反应。许多药物因 PH值≥10时，其中的阴离子会吸收鲎试剂中的Ca2+、 Mg2+离子，使实验呈假阴性。
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4 样品成份及理化性质的影响
β-葡聚糖样物质的影响 PH值的影响 金属离子和弱酸阴离子的影响 药物浓度的影响
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1） β-葡聚糖样物质的影响
常见现象：假阳性。
鲎试剂的特异性系指在药品、生物制品和血液制 品中鲎试剂能准确测出被测物质内毒素的能力， 既不能造成样品内毒素的漏检，也不能将其它物 质错判为内毒素。
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2） 细菌内毒素标准品效价误差
细菌内毒素国家标准品与细菌内毒素工作标准品 之间或细菌内毒素工作标准品与细菌内毒素工作 标准品之间的生物效价存在一定的误差，用不同 细菌内毒素标准品复核同一批鲎试剂灵敏度时可 能 存 在 一 定 的 误 差 。 中 国 药 典 要 求 “ 当 λc 在 0.5λ-2λ(包括0.5λ和2λ)时，方可用于细菌内毒素 检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏 度。”试验结果只要在这合格范围内表示鲎试剂 标示灵敏度准确。
应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿 必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有的客 户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿， 结果试验中所有的阳性对
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照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较 大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造 成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤 不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂 酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准 确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作 规程，用多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。
鲎试剂灵敏度的误差 是否用细菌内毒素国家标准品标定？ 标示值是否准确？
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2 细菌内毒素标准品引起的误差
细菌内毒素标准品种类 细菌内毒素标准品效价误差 细菌内毒素标准品操作误差 细菌内毒素单位表示误差 细菌内毒素标准品的错误使用
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1） 细菌内毒素标准品种类 ➢细菌内毒素国际标准品 ➢细菌内毒素国家标准品 ➢细菌内毒素工作标准品
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3） 内毒素标准品操作误差
正确 （易折点）错误
取细菌内毒素工作标准一支， 轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底， 再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕， 用75%酒精棉球擦拭后启开 ， 防止玻璃屑落入瓶内。
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注意：①只能在安瓿的易折点上部开启内毒素， 不能沿易折点开启，防止振荡过程中内毒素粘在 封口膜上。
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目前我公司研究证明，已知能与鲎试剂发生反应的 物质有细菌内毒素和β-葡聚糖，而内毒素反应曲 线为S型特征曲线，β-葡聚糖反应曲线为经过0点 的斜线。鲎试剂的特异性差的另一种表现，是将其 它物质（如β-葡聚糖）判定为内毒素，错误将合 格药品判为不合格，造成制药厂直接经济损失。
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鲎试剂反应机理图
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判断假阳性的方法： 1、特异性鲎试剂法； 2、定量反应曲线分析法； 3、家兔模拟试验法。
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2） PH值对反应速度的影响 常见现象：样品阳性不成立。
相 对
7.0
活
鲎试剂与内毒素反应的最适宜pH 力
在6.5-8.0；pH ≤3 或≥10时，
酶活性受到抑制。
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9
3 实验器皿的影响
器皿的计量管理（校正） 器皿的选择标准 器皿的正确处理
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1） 器皿的选择标准
鲎试验对器皿的要求：刻度准确；内表面光 滑；易于清理。细菌内毒素检查实验不宜选用 注射器，最好使用经过校正的刻度玻璃吸管或 吸嘴。注射器刻度不精确，内壁磨沙面吸附内 毒素，而且要特别注意注射器针头引入的铁离 子对试验结果的干扰，故不宜选用注射器。