《基因工程》PPT课件

请举出三个以上的例子
供体生物细胞
2、获取目的基因的常用方法
（1）从基因文库中获取 （2）利用PCR技术扩增 （3）人工化学合成
限制酶
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取出 DNA 用限制酶剪 去多余部分
目的基8因
基因文库的构建方法之一 （1）直接分离法
提取某种生物的全部DNA 用适当的限制酶切
一定大小的DNA片段
将DNA片段与载体连接 导入受体菌中储存
在两个DNA片段之间形 成磷酸二酯键
将单个核苷酸加到已存 在的核酸片段的3′端的 羟基上，形成磷酸二酯 键
作用结果
将存在的DNA片段连接 成重组DNA分子 .
合成新的DNA分子
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基因的运输工具——运载体
1.作用：将外源基因导入受体细胞。 2.常用种类：质粒、噬菌体和动植物病毒。
a．对受体细胞无害，不影响受体细胞正常的生命活动。
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PCR技术
• 原理： DNA复制 • 前提：
一段已知目的基因的核苷酸序列 • 原料
模板DNA；DNA引物；四种脱氧 核苷酸；热稳定DNA聚合酶 （Taq酶）
• 方式：以_指__数__方式扩增，
PCR扩增仪
即_2_n__（n为扩. 增循环的次数） 18
PCR技术扩增与DNA复制的比较
PCR技术
– 一般选择能在目的基因两端形成不同末端的双酶切， 此法还可减少载体和目的基因的自身环化（但应注意 双酶切去除片段不能包含必需元件！）
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基因表达载体的组成：
复制原点+目的基因+启动子+终止子+标记基因
它们各自 的作用是 什么?
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启动子：位于基因的首端的 一段特殊的DNA片断，它 是RNA聚合酶识别和结合的 部位，有了它才能驱动基因 转录出mRNA，最终获得蛋 白质
蛋白质的氨 推
mRNA 推 基因DNA的 合
基酸顺序 测 核苷酸序列 测 核苷酸序列 成
目的 基因
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DNA合成仪
目的基因能直接进入受体细胞吗?
基因表达载体的作用
a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代 b、同时使目的基因能表达和发挥作用
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二、基因表达载体的构建—核心
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二、基因表达载体的构建—核心
2020/5/30
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1010
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②反转录法：
mRNA 反转录
cDNA (互补DNA）
DNA聚合酶 双链DNA
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基因文库的构建方法之二 反转录法：cDNA的合成流程图解
某种生物的单链mRNA
反（逆）转录酶 单链互补DNA DNA聚合酶
双链cDNA片段
与载体连接 导入受体菌中储存
cDNA文. 库
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二、基因表达载体的构建—核心
目的基因
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选择限制酶的要求
• 不在目的基因、载体上的复制原点、启动子、终 止子序列内部切割
• 在载体上只能切开一个缺口（保证表达载体的完 整性）
• 保证酶切后目的基因与载体末端相同（黏性末端 互补或同为平端）
• 与载体连接后，应使目的基因与载体上启动子的 转录方向一致
b．具标记基因。
c．能自我复制。通过复制进行基因扩增，否则可能会使
重组DNA丢失。
d．具有一个或多个限制酶切点，供外源基因插入其中。
②常用载体——质粒：裸露的，结构简单且独立于细菌染色
体DNA之外的，具有自我复制能力的小型环状DNA分子。
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最常用的运载体——质粒
分布：存在于许多细菌以及酵母菌等生物中。
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(二)利用PCR技术扩增目的基因
PCR——聚合酶链式反应
是一项生物体外复制特定DNA片 段的核酸合成技术。通过此技术，可 获取大量的目的基因。
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过程
高温变性（解旋为单链）
低温退火（引物与单链互补结合）
适温延伸（在Taq酶的作用下合成 与模板互补的DNA双链）
重复循环
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实际具体过程
最常用的质粒是大肠杆菌的质粒。
本质：细胞染色体(或拟核)外能自主复制的小型 环状DNA分子。
标记 基因
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基因工程的基本操作程序
1、目的基因的获取
2、基因表达载体的构建
3、将目的基因导入受体细胞
4、目的基因的检测与鉴定
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基因操作的基本步骤
1一、、目目的的基因基主因要的是获指取___编__码__蛋__白__质__的__结__构__基__因_
基因工程的原理
1、概念：
基因工程又叫做基因拼接技术或DNA重组技术。 通俗地说，就是按照人们的意愿，把一种生物的某种 基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物 的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。
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1
2. 基因工程最基本的工具 ──限制性内切酶
以大肠杆菌中的一种叫做EcoRІ的限制酶为例：
限制酶
终止子：位于基因的尾端的 一段特殊的DNA片断，能 终止mRNA的转录
标记基因的作用是为了鉴别
受体细胞中是否含有目的基
因，从而将有目的基因的.细
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1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 ABCD
A．目的基因 B．启动子 C．终止子 D．标记基因
2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A
A．启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起
始密码
B．启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对
mRNA的转录起调控作用
C．标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因
DNA复制
相 原理 同 原料 点 条件
碱基互补配对 四种脱氧核苷酸 模板、能量、酶
Leabharlann Baidu
解旋 DNA在高温下变性解旋
不 方式
同 场所
体外复制
点 酶 热稳定的DNA聚合酶
解旋酶催化 细胞核内 细胞内的DNA聚合酶
结果
大量的DNA片段
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形成整个DNA分子
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（三）人工合成
当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得 或核苷酸序列已知时，可采用此种方法通过DNA合 成仪直接合成目的基因。
结果：产生黏性未端（碱基互补配对）。
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基因的针线──DNA连接酶
作用：将互补配对的两个黏性末端缝隙 连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。
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DNA连接酶与DNA聚合酶的比较
作用实质
是否需模板
连接 DNA链
DNA连接酶
DNA聚合酶
都是催化两个核苷酸之间形成磷酸二酯键
不需要
需要
双链
单链
作用过程
基因组文库
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基因文库的构建方法之二: cDNA合成法
• 第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补 的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。
• 第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链 降解，使之变成单链的DNA。
• 第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下 合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。