临床色谱质谱检验技术：第六章 色谱质谱技术的其他常见应用(一)
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高效液相色谱技术应用于氨基酸检测 电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析 三重四级杆技术应用于遗传代谢性疾病检测
《临床色谱质谱检验技术》
色谱技术在临床实验室中的应用
回顾
什么是色谱分析？ 色谱分析的分类有哪些？ 常见样品制备技术有哪些？
回顾
色谱分析
色谱分析是一种分离技术 色谱分析的主要目的是对混合物中的目标物进行分离和定量
色谱技术在临床实验室中的应用
样品 采集
样品 制备
分析 测定
样品处理 方法建立
色谱方法 建立
数据 处理
信息及文 献检索
信息及文献检索
氨基酸：是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成
动物营养所需蛋白质的基本物质。 氨基酸含有一个碱性氨基和一个酸性羧基，氨基一般连在ɑ-碳 上。组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳 原子，即ɑ-碳原子。
柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂/ 弱酸盐缓冲液为流动相。
HPLC中广泛使用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛（OPA）、9-芴基甲氧 基羰酰氯（FMOC）、异硫氰酸苯酯（PITC）、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰 亚胺基氨基甲酸酯（AQC）、二甲氨基奈磺酰氯（dansyl-Cl）、2，4-二硝 基氟苯（FDNB）、等。
O
茚三酮
OH
R CH COOH
OH O
NH2
还原形茚三酮
O H
OH O
RCHO
O
O
O
OH
H
NH3
OH
HO
O
O
兰紫色化合物
N O
CO2 O O
NБайду номын сангаас3
伯 胺 型
O
O
仲
OH
COOH N
N
胺
OH
O
H
黄绿色化合物
O
型
衍生化高效液相色谱法
衍生化高效液相色谱法(柱前衍生)
柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多 样、灵敏度高的优点，已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的 应用。
衍生化高效液相色谱法
方法
邻苯二醛（OPA）和9-芴甲 基氯甲酸甲酯（FMOC）法
异硫氰酸苯酯 （PITC）法、
6-氨基喹啉－N－羟基琥珀 酰亚氨基氨基甲酸酯 （AQC）法
衍生方式 衍生化条件
色谱柱
检测器
柱前
30s
C18 激发波长340nm，发射波 长450nm（伯胺），激发
波长260nm，发射波长 305nm（仲胺）
所有的氨基酸在低pH值的条件下（pH为2.2）都带有正电荷，在阳离子 交换树脂上均被吸附。
其中吸附程度：碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨 基酸、酸性氨基酸结合力最弱。
被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应。
衍生化离子交换色谱法
茚三酮反应原理
脯氨酸与茚三酮反应：波长440nm检测
样品制备
除蛋白：
酸沉淀：主要使用磺基水杨酸（SSA）沉淀蛋白 有机溶液沉淀 超滤和高速离心 透析
样品制备
蛋白质和多肽中氨基酸的分析：
酸水解 较多采用盐酸水解（6mol/L HCL，110℃，20～24h），加入保护剂，减少氨基
酸的损失（天冬酰胺和谷氨酰胺变成天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸变成为胱氨酸） 碱水解
气相色谱 液相色谱
气相色谱仪器的构成
气相色谱仪器的构成
五个基本组成系统：气路系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。
液相色谱仪器的构成
液相色谱仪器的构成
五个基本组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系 统。
进样系统
分离系统
高效输液系统 检测系统
样品制备技术
常见样品制备技术
固相萃取
衍生化
稀释
样品制备
过滤
液液萃取
离心
蛋白沉淀
方法学验证的内容
携带 效应
准确 度
精密 度
干扰
线性
验证
方法
范围
验证
稳定 性
基质特 异性
可报告 范围
基质效 应
色谱技术在临床实验室中的应用
除了气相色谱质谱联用技术、液相色谱质谱联用技术之外 ，色谱技术在临床上还有其他的常见应用。 液相色谱技术应用于氨基酸检测 液相色谱技术应用于血药浓度检测 高效毛细管电泳技术应用于地中海贫血检测
分析测定方法
样品制备
样品制备包括采集、离心、存储和除蛋白。
采集：确保被试者没有服用任何影响氨基酸测定的药物，同时采血在早晨空腹的 情况下进行，以免饮食因素对结果产生影响。 离心和存储：采集后的标本，应尽快离心，离心后放在低于-18℃的条件下存储。 （为了防止蛋白水解，离心之后不宜立即除去蛋白） 除蛋白： 常见有酸沉淀、有机溶液沉淀、超滤、高速离心和透析等。
信息及文献检索
ɑ-碳原子有四个不同取代基：氨基、羧基、氢原子和R基团
，不同氨基酸的R基团不同。 每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L构型。
信息及文献检索
氨基酸在溶液中受溶液pH的影响存在着下列平衡：
pH>pI
pH=pI
pH<pI
偶极离子——净电荷为零——在电场中不移动， 此时溶液的pH值称为等电点（pI）
柱前 室温1h
C18
紫外检测器254nm
多用于色氨酸的测定，主要使用氢氧化钠或氢氧化钾 酶水解
用于化学水解敏感的氨基酸的测定，如天冬酰胺和谷氨酰胺，需较长的反应时间 微波消解
衍生化离子交换色谱法
衍生化离子交换色谱法
衍生化离子交换色谱法（柱后衍生）
分析原理：基于阳离子交换树脂分离-柱后茚三酮衍生化分光光度检测方
法。
天冬氨酸的pI值为2.98
目标
熟悉：
电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析 三重四级杆技术应用于遗传代谢性疾病检测
了解：
高效液相色谱技术应用于氨基酸检测 液相色谱技术应用于血药浓度检测 毛细管电泳技术应用与地中海贫血检测 基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术应用于微生物鉴定
第六章教学要求
教学形式及学时
教学形成：理论教学 学时：3
《临床色谱质谱检验技术》
第六章 色谱质谱技术 的其他常见应用
2016.05.03
主要内容
《临床色谱质谱检验技术》
本章教学要求 色谱技术在临床实验室中的应用 小结与思考
第六章教学要求
目的
回顾之前所学色谱质谱知识，与实践相结合； 熟悉和了解色谱质谱技术在临床实验室中的其他常见应用情况。
第六章教学要求
O
O
OH
+N
OH H
O
COOH
+ N O-
其它氨基酸与茚三酮反应：波长570nm检测
O
O
OH
OH OO
+ R CH COOH
NH 2 O
H
+ + RCHO CO2
OH
O
O
O
+NH 3
OH
H
+ + NH3
N
OH
OH
O
O
O
O-
衍生化离子交换色谱法
+ 伯胺型氨基酸
茚三酮
+
仲胺型氨基酸
兰紫色化合物 黄绿色化合物
《临床色谱质谱检验技术》
色谱技术在临床实验室中的应用
回顾
什么是色谱分析？ 色谱分析的分类有哪些？ 常见样品制备技术有哪些？
回顾
色谱分析
色谱分析是一种分离技术 色谱分析的主要目的是对混合物中的目标物进行分离和定量
色谱技术在临床实验室中的应用
样品 采集
样品 制备
分析 测定
样品处理 方法建立
色谱方法 建立
数据 处理
信息及文 献检索
信息及文献检索
氨基酸：是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成
动物营养所需蛋白质的基本物质。 氨基酸含有一个碱性氨基和一个酸性羧基，氨基一般连在ɑ-碳 上。组成蛋白质的20种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳 原子，即ɑ-碳原子。
柱前衍生化高效液相色谱法一般采用C18键合硅胶为固定相、极性溶剂/ 弱酸盐缓冲液为流动相。
HPLC中广泛使用的衍生化试剂主要有邻苯二甲醛（OPA）、9-芴基甲氧 基羰酰氯（FMOC）、异硫氰酸苯酯（PITC）、6-氨基喹啉-N-羟基琥珀酰 亚胺基氨基甲酸酯（AQC）、二甲氨基奈磺酰氯（dansyl-Cl）、2，4-二硝 基氟苯（FDNB）、等。
O
茚三酮
OH
R CH COOH
OH O
NH2
还原形茚三酮
O H
OH O
RCHO
O
O
O
OH
H
NH3
OH
HO
O
O
兰紫色化合物
N O
CO2 O O
NБайду номын сангаас3
伯 胺 型
O
O
仲
OH
COOH N
N
胺
OH
O
H
黄绿色化合物
O
型
衍生化高效液相色谱法
衍生化高效液相色谱法(柱前衍生)
柱前衍生化高效液相色谱法分析氨基酸具有分析时间较短、方法灵活多 样、灵敏度高的优点，已经逐渐取代衍生化离子交换色谱法在许多领域中的 应用。
衍生化高效液相色谱法
方法
邻苯二醛（OPA）和9-芴甲 基氯甲酸甲酯（FMOC）法
异硫氰酸苯酯 （PITC）法、
6-氨基喹啉－N－羟基琥珀 酰亚氨基氨基甲酸酯 （AQC）法
衍生方式 衍生化条件
色谱柱
检测器
柱前
30s
C18 激发波长340nm，发射波 长450nm（伯胺），激发
波长260nm，发射波长 305nm（仲胺）
所有的氨基酸在低pH值的条件下（pH为2.2）都带有正电荷，在阳离子 交换树脂上均被吸附。
其中吸附程度：碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨 基酸、酸性氨基酸结合力最弱。
被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应。
衍生化离子交换色谱法
茚三酮反应原理
脯氨酸与茚三酮反应：波长440nm检测
样品制备
除蛋白：
酸沉淀：主要使用磺基水杨酸（SSA）沉淀蛋白 有机溶液沉淀 超滤和高速离心 透析
样品制备
蛋白质和多肽中氨基酸的分析：
酸水解 较多采用盐酸水解（6mol/L HCL，110℃，20～24h），加入保护剂，减少氨基
酸的损失（天冬酰胺和谷氨酰胺变成天冬氨酸和谷氨酸，半胱氨酸变成为胱氨酸） 碱水解
气相色谱 液相色谱
气相色谱仪器的构成
气相色谱仪器的构成
五个基本组成系统：气路系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统。
液相色谱仪器的构成
液相色谱仪器的构成
五个基本组成系统：高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系 统。
进样系统
分离系统
高效输液系统 检测系统
样品制备技术
常见样品制备技术
固相萃取
衍生化
稀释
样品制备
过滤
液液萃取
离心
蛋白沉淀
方法学验证的内容
携带 效应
准确 度
精密 度
干扰
线性
验证
方法
范围
验证
稳定 性
基质特 异性
可报告 范围
基质效 应
色谱技术在临床实验室中的应用
除了气相色谱质谱联用技术、液相色谱质谱联用技术之外 ，色谱技术在临床上还有其他的常见应用。 液相色谱技术应用于氨基酸检测 液相色谱技术应用于血药浓度检测 高效毛细管电泳技术应用于地中海贫血检测
分析测定方法
样品制备
样品制备包括采集、离心、存储和除蛋白。
采集：确保被试者没有服用任何影响氨基酸测定的药物，同时采血在早晨空腹的 情况下进行，以免饮食因素对结果产生影响。 离心和存储：采集后的标本，应尽快离心，离心后放在低于-18℃的条件下存储。 （为了防止蛋白水解，离心之后不宜立即除去蛋白） 除蛋白： 常见有酸沉淀、有机溶液沉淀、超滤、高速离心和透析等。
信息及文献检索
ɑ-碳原子有四个不同取代基：氨基、羧基、氢原子和R基团
，不同氨基酸的R基团不同。 每种氨基酸有D-构型和L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是L构型。
信息及文献检索
氨基酸在溶液中受溶液pH的影响存在着下列平衡：
pH>pI
pH=pI
pH<pI
偶极离子——净电荷为零——在电场中不移动， 此时溶液的pH值称为等电点（pI）
柱前 室温1h
C18
紫外检测器254nm
多用于色氨酸的测定，主要使用氢氧化钠或氢氧化钾 酶水解
用于化学水解敏感的氨基酸的测定，如天冬酰胺和谷氨酰胺，需较长的反应时间 微波消解
衍生化离子交换色谱法
衍生化离子交换色谱法
衍生化离子交换色谱法（柱后衍生）
分析原理：基于阳离子交换树脂分离-柱后茚三酮衍生化分光光度检测方
法。
天冬氨酸的pI值为2.98
目标
熟悉：
电感耦合等离子体质谱技术应用于元素分析 三重四级杆技术应用于遗传代谢性疾病检测
了解：
高效液相色谱技术应用于氨基酸检测 液相色谱技术应用于血药浓度检测 毛细管电泳技术应用与地中海贫血检测 基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术应用于微生物鉴定
第六章教学要求
教学形式及学时
教学形成：理论教学 学时：3
《临床色谱质谱检验技术》
第六章 色谱质谱技术 的其他常见应用
2016.05.03
主要内容
《临床色谱质谱检验技术》
本章教学要求 色谱技术在临床实验室中的应用 小结与思考
第六章教学要求
目的
回顾之前所学色谱质谱知识，与实践相结合； 熟悉和了解色谱质谱技术在临床实验室中的其他常见应用情况。
第六章教学要求
O
O
OH
+N
OH H
O
COOH
+ N O-
其它氨基酸与茚三酮反应：波长570nm检测
O
O
OH
OH OO
+ R CH COOH
NH 2 O
H
+ + RCHO CO2
OH
O
O
O
+NH 3
OH
H
+ + NH3
N
OH
OH
O
O
O
O-
衍生化离子交换色谱法
+ 伯胺型氨基酸
茚三酮
+
仲胺型氨基酸
兰紫色化合物 黄绿色化合物