发酵工程在现代生物技术中的应用
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2、培养条件对工程菌稳定性的影响
对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条 件是进行工业化生产的关键 步骤。 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属 未知。 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的 比生长速率3个方面尤其重要。
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1）培养基的组成
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2）菌体比生长速率
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4、控制基因过量表达
提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产 率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。
可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过 量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷 贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。
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1）可诱导性启动子
在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如： lac、 trp、 PL等
在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选 择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去 阻遏（诱导）使质粒高效表达。
例如： 利用3--吲哚乙酸可使trp启动子去阻遏
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2）温度敏感型质粒
一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少， 当温度升高到一定值时质粒大量扩增
—— 脱缰质粒 （runaway plasmid）
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但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在 无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109 个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应 器中就含有109个无质粒细胞。 质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶 氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。 许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在 一起形成一个单位。
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质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但 质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细 胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发 生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源 蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基 中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来 的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的 质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳 定性。
第八章
发酵工程在现代生物技术中的应用
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第 一节 基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目 标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
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（一）工程菌的稳定性
• 1、基因工程菌不稳定的表现 • 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量
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表达产物的不稳定性
宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突 变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。 例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞 的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改 变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是 操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的 基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进 入细胞，从而不能启动细胞的表达。
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2）抗生素依赖变异法
通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖型变异株——即 只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长。 而重组质粒上含该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入 宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。 因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能 达到消除重组质粒分配不稳定性 的目的。
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3）营养缺陷型法
通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因， 而将该基因插入到重组质粒中。 然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能 存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。
外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是 致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生 长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这 就导致基因的不稳定性。 • 基因的不稳定性原因： • 质粒分离丢失、 • 结构不稳定性 • 表达产物的不稳定性（宿主细胞调节突变）
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质粒丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离 丢失。质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。 低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等 的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子 代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一 些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形 成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中 一个）。
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3）培养温度
通常，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。
4） pH和溶解氧
pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响， 所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的 调节 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重 要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的 氧供给，提高活菌产量。
比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并 可能与克隆菌本身和培养条件有关。
例如: 在酵母系统中，大则质粒pJDB248稳定性高。
如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程 菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果； 调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。 但很难达到
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AmpR
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TcR
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将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后， 克隆菌也获得了抗药性。 在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素， 就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。
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但这种方法在大规模生产时并不可取, 因为：
成本增加 对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的 选择压力只能维持一定的时间 添加抗生素对结构性不稳定无能为力 抗生素的存在可能会影响目的产物的合成给产物的提取带来 困难
如：pKN410在30℃时的拷贝数为20～50/E.coli细胞；在
35℃时质粒大量复制。
将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增 400倍。
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5、施加选择压力
从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得 只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。
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1）抗生素添加法
通常在重组质粒上含有抗药性基因
2、培养条件对工程菌稳定性的影响
对于一个已经组建完成的工程菌来说，选择最适的培养条 件是进行工业化生产的关键 步骤。 环境因素对质粒稳定性的影响机制错综复杂，许多尚属 未知。 在众多的环境因素中，培养基的组成、培养温度、菌体的 比生长速率3个方面尤其重要。
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1）培养基的组成
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2）菌体比生长速率
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4、控制基因过量表达
提高质粒稳定性的目的是为了提高克隆菌的发酵生产 率，但外源基因表达水平越高，重组质粒往往越不稳定。
可采用两阶段培养法，即在发酵前期控制外源基因不过 量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过提高质粒的拷 贝数或转录、翻译效率使外源基因高效表达。
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1）可诱导性启动子
在构建表达载体时，可使用可诱导性的启动子，如： lac、 trp、 PL等
在用含有这些启动子的克隆菌进行发酵生产时，可以选 择培养条件使启动子受阻遏（抑制）到一定时期；然后去 阻遏（诱导）使质粒高效表达。
例如： 利用3--吲哚乙酸可使trp启动子去阻遏
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2）温度敏感型质粒
一些温度敏感型质粒在温度较低时质粒拷贝数较少， 当温度升高到一定值时质粒大量扩增
—— 脱缰质粒 （runaway plasmid）
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但在大的反应器中含有非常多的细胞，总会存在 无质粒细胞，例如1000L发酵液，每毫升有109 个细胞，总共就有1015个细胞，那么在这个反应 器中就含有109个无质粒细胞。 质粒的分离丢失可能受许多环境因素影响，如溶 氧、温度、培养基组成和恒化器中的稀释速率。 许多质粒也会形成多聚体，它是相同质粒附着在 一起形成一个单位。
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质粒结构不稳定性
除了分离不稳定性问题外，某些细胞保留质粒，但 质粒结构发生改变，而不产生外源蛋白，减少对细 胞的有害影响，这就是结构不稳定性。如果质粒发 生突变，仍保留了抗生素抗性基因，但不合成外源 蛋白，那么这些突变株仍能在含有抗生素的培养基 中生长。而且由于不合成外源蛋白，生长得比原来 的工程菌更快，使得在这种培养物中带有改变了的 质粒占统治地位的菌，这种培养情况就是结构不稳 定性。
第八章
发酵工程在现代生物技术中的应用
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第 一节 基因工程菌的发酵
• 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目 标产物，工程菌和常规微生物并无太多的 差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产 过程中表现出不稳定性，以及安全性等问 题，使得工程菌的培养有着自身所特有的 特点。
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（一）工程菌的稳定性
• 1、基因工程菌不稳定的表现 • 生产的目标是得到最大量的外源蛋白，但是大量
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表达产物的不稳定性
宿主细胞的突变也会造成生产能力的减少。这些突 变通常改变细胞调节，结果减少目标蛋白的合成。 例如，控制外源蛋白表达的启动子，利用宿主细胞 的启动子，如果宿主细胞启动子的改变，将大大改 变质粒编码蛋白的生产水平。乳糖操纵子是常用是 操纵子，通过加入乳糖或它的结构类似物（如IPTG） 来启动表达，如果乳糖操纵子编码半乳糖苷透酶的 基因发生突变就会阻止乳糖或乳糖的结构类似物进 入细胞，从而不能启动细胞的表达。
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2）抗生素依赖变异法
通过诱变使宿主细胞成为某抗生素的依赖型变异株——即 只有在该抗生素存在时宿主细胞才能生长。 而重组质粒上含该抗生素的非依赖性基因，将重组质粒导入 宿主细胞后，所得的克隆菌就能在不含抗生素的培养基中生长。 因此在进行发酵生产时，不需要向培养基中加入抗生素就能 达到消除重组质粒分配不稳定性 的目的。
-wk.baidu.com
3）营养缺陷型法
通过诱变使宿主细胞染色体缺失生长所必需的某一基因， 而将该基因插入到重组质粒中。 然后选择适当组成的培养基使失去重组质粒的细胞不能 存活，而只有含重组质粒的细胞才能生长。
外源蛋白的形成对宿主细胞是有损害的，通常是 致死的，失去制造外源蛋白的能力的细胞一般生 长得快得多，从而能替代有生产能力的菌株，这 就导致基因的不稳定性。 • 基因的不稳定性原因： • 质粒分离丢失、 • 结构不稳定性 • 表达产物的不稳定性（宿主细胞调节突变）
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质粒丢失
当细胞分裂时一个子细胞没有接受质粒就出现分离 丢失。质粒可分为高拷贝质粒（>20拷贝/细胞）和 低拷贝质粒（有时低到每个细胞一至二个拷贝）。 低拷贝质粒有专门的机制保证在子代细胞中有相等 的分配，高拷贝质粒通常很少遵循二分法分配到子 代细胞。对于高拷贝质粒，几乎所有子细胞接受一 些质粒，也有可能有的细胞没有接受质粒，当然形 成无质粒细胞的可能性是低的（每百万细胞分裂中 一个）。
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3）培养温度
通常，低温往往有利于重组质粒稳定地遗传。
4） pH和溶解氧
pH对细胞的正常生长和外源蛋白的高效表达都有影响， 所以应根据工程菌的生长和代谢情况，对pH进行适当的 调节 溶解氧是工程菌发酵培养过程中影响菌体代谢的一个重 要参数，对菌体的生长和产物的生成影响很大。 外源基因的高效表达和翻译需要维持较高水平的DO2值。 通常采用调节搅拌转速的方法，可以改善培养过程中的 氧供给，提高活菌产量。
比生长速率对重组质粒稳定性的影响结果不尽一致，并 可能与克隆菌本身和培养条件有关。
例如: 在酵母系统中，大则质粒pJDB248稳定性高。
如果不含重组质粒的宿主细胞不比含有重组质粒的工程 菌生长快，则重组质粒的丢失也不会导致非常严重的后果； 调整这两种菌的比生长速率可以提高重组质粒的稳定性。 但很难达到
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将含有抗药性基因的重组质粒转入不耐药的宿主细胞后， 克隆菌也获得了抗药性。 在克隆菌发酵时，于培养基中加入适量的相应抗生素， 就可阻止丢失了重组质粒的非生产菌的生长。
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但这种方法在大规模生产时并不可取, 因为：
成本增加 对于一些易被酶水解失活的抗生素来说，添加抗生素造成的 选择压力只能维持一定的时间 添加抗生素对结构性不稳定无能为力 抗生素的存在可能会影响目的产物的合成给产物的提取带来 困难
如：pKN410在30℃时的拷贝数为20～50/E.coli细胞；在
35℃时质粒大量复制。
将-内酰氨酶基因接在其上，经热诱导后，酶活可扩增 400倍。
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5、施加选择压力
从遗传学来说，选择意味着利用某些生长条件使得 只有那些具有一定遗传特性的细胞才能够生长。
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1）抗生素添加法
通常在重组质粒上含有抗药性基因