发酵过程检测与传感器

1）操作特性 ａ）离线（off-line） ｂ）在线（on-line）：设备一部分，检测值不直接用于控制，输 入后调控 pH，溶氧，二氧化碳溶解 ｃ）原位（in-line）：设备一部分，检测值直接用于控制, 温度 2）采用不同检测原理的传感器： ａ）力敏传感器：压敏传感器，压差传感器
ｂ）热敏传感器：温度，热量传感器
发酵过程检测与传感器
发酵影响因素：内部 外部 调控：环境因素调节至最优-模型化，自动化 参数检测-传感器
过程控制和监测
Agitation pH Cell Dry Weight Product Sugar consumption Temperature
Fermentation time (h)
第一节 概述
--测定大分子物质较正确，尤其用双缩脲反应测定蛋白质 简单而快速。由于这些大分子物质的比例在细胞中随着时间变 化，因此所选被测样的菌体应处于对数生长期，此时生长速度 恒定，细胞组成也恒定。 （Lowrey法：可检出10微克级蛋白质，易受葡萄糖尿素 干扰 ； 双缩脲法：可检出毫克级蛋白质，受多肽的影响）
贵金属阴极（Ag or Pt）+碱金属阳极（Ｐb or Sn） +电解质溶液（醋酸铅、醋酸钠、乙酸）
银-铅溶氧电极
阴极：O2+2H2O+4e-→4OH阳极：Pb → Pb 2+ +2e-
总反应：O2+2Ｐb+4H2O →2H2O+ 2 Pb(OH)2
图6-8 几种常见电流电极的结构
b) 极谱电极
重金属阴极（Au or Pt）+阳极（Ag or AgCl） +电解质溶液（ AgCl or KCl）+负偏压 阴极：O2+2H2O+2e-→H2O2+2OHH2O2+2e- →2OH阳极： Ag+Cl- → AgCl+e总反应：O2+4Ag+2H2O+4Cl- →4AgCl+ 4OH经常更换电解质
1）校准：一种或者多种标准缓冲液中，发酵温度下 2）灭菌：罐内灭菌：连接物取开 罐外酒精灭菌：无水乙醇中1小时以上，连接时罐 内通入蒸汽 3）校准的检查：移出 罐外测定校准
2 维护
1）填充或者充满电解液 2）清洗：10mmol/L HCl 3) 防止机械损坏
第三节 发酵过程中溶氧的检测及溶氧电极
1 传感器：非电信号-电信号 延迟 2 工作特性： --无菌（o型环或者双o型环） --高度可靠性及稳定性（双探头）， 满足：温度，压力， --准确度，精度，分辨率（调整位置，再校准）， --响应速度（测量值达到终值90%的时间） 3 传感器的分类 关键组成部分
检测对象：数量，长度，面积，体积，压力，水分，离子强度， 湿度，温度等
2 细胞堆积容积测量法：
用锥形刻度管测量经离心的细胞沉淀物的容积，以间接表示细胞重量的 生长测定法。
--实际生产中常用。由于细胞密度随时间的变化很小（1.05-1.1）。而且 细胞比其他固体物沉降慢，可凭经验直观将二者区别，因而具有一定的正确 性。
3 细胞组成分析法
测定一种大分子的细胞组成(蛋白质、RNA、DNA等)，间 接地算出细胞重量的生长。
氧溶解浓度：细胞生长，产物的生成 测定通性：采用膜将测定点与发酵液分开，需要校准 1）导管法：导管内充满惰性气体，氧从发酵液扩散至管中， 在出口处采用氧气分析仪分析 扩散动力：浓度差 特点：响应慢，校准难，，可以原位灭菌 2）质谱仪电极：膜隔开发酵液，质谱测氧（可扩散成分）
3）电化学电极：膜隔开发酵液，氧扩散，氧化还原反 应,见图6-6 。
一 、发酵过程检测的参数
图6-2
具有检测与控制设备的标准发酵装置(a) 和具有更为复杂的检测控制设备的发酵装置(b)
表6-1发酵过程物理参数的测定
电极法，生物传感器：葡萄糖，酒精，青霉素 计算：尾气分析—耗氧速率，二氧化碳释放率，呼吸商—基质消耗
发酵工程试验 118页表2 表三
二、用于发酵过程检测的传感器
三 其它理化方法和活菌平板计数法。
原则：有效，快速、简便
第五节 发酵过程中其它参数的监测及传感器
一 温度
温度计， 热敏电阻，热电偶，热电阻 热电阻（电阻随温度变化）： 惠斯通电桥 温度计置于夹套中 二 压力
安全考虑测定压力，气升式反应罐 隔膜式压力表：将压力信号转变为电信号，管路需耐受高温灭菌 方法 ： 压电现象：施加于不对称晶体上的压力产生弹性形变，产生电流 可变电阻：半导体出片上的弯曲影响其电阻系数
图6-6 电化学溶氧电极结构示意图
图6-7 可灭菌的极谱式溶氧电极
一 溶氧电极装置 1 工作原理
电化学电极：氧透过膜，电化学室内发生氧化还原反应产生电势 极谱电极：氧扩散至碱性水溶液中的电化学池内，氧浓度与通过细胞的电量 成正比。
区别：前者无外加电压，原因：前者产生的电压足以降低阴极表面的氧
a) 电流电极:
三 黏度的检测及粘度计（略）
四 溶解CO2传感器 CO2溶解水平影响细胞的生理学性质，代谢分析中使用
五 泡沫电极
图6-10 生物反应器中泡沫的形成
危害： 损失发酵液，污染过滤器，排气系统堵塞 消泡：机械 化学试剂 1 电容传感器：出现气泡，电容发生改变 2 热导泡沫电极：泡沫与加热后的电极接触导致电极冷却 缺点：结垢和喷溅问题
4 营养物消耗分析法
测定培养基中不用于合成代谢产物的营养物（磷酸盐、硫 酸盐等）的消耗，由此间接表示细胞重量的生长。
--适用于菌体细胞是主要产物时生长的测定，可由磷源和 氧的消耗间接地表示细胞重量。
Hale Waihona Puke Baidu
5 产物重量分析法
测定培养中途形成的二氧化碳，氢，ATP等产物，由此间 接地换算出细胞重量的生长。 例如：一般细菌细胞的ATP含量大约是1mgATP/g干细菌 细胞，因此测定中间产物ATP便可算出细胞重量。
4 其他 --膜外表面存在微生物的生长 --硫化氢、二氧化硫、有机硫化物会毒化阴极 --位置
第四节 菌体浓度和生物量的检测
一 定细胞数目： 1 浊度计比浊法 测定稀的细胞悬液的透光量，间接测出细胞数量的生长 测定法，此法简单而快速，但只适用于色浅和其它悬粒极少 的悬浮液测定。由于悬浮液浓度只有一定范围内与光穿透的 量成反比，所以应事先将悬浮液浓度控制在一定的范围。 2 计数器计数法： 显微镜下用血球计数器直接数出酵母菌或霉菌孢子数目， 以及用细菌计数片直接测出细菌数的生长测定法。 速度快，若用活体染色剂（亚甲基蓝）染色还可测出活 菌数。
ｃ）电化学传感器：化学反应为基础，非电信号-电信号(pH)
d) 光敏传感器：光导纤维，光电管
4 传感器的选用 1）性能：量程，灵敏度，分辨率，精度，准确度，响 应时间等 2）测量条件：测量范围，要求的精度等 3）传感器的使用条件：环境等
第二节 pH检测及传感器
生长，生物催化，培养基制备，产物分离纯化 一 pH传感器的工作原理
图6-9 使用O形环的氧电极膜安装系统
b) 电解液：定期更换 c) 安装及灭菌：灭菌时导线短接 三 溶氧电极的使用 1 搅拌的影响：最初的校准时搅拌 2 温度：温度影响扩散—温度补偿 3 压力影响： P(O2) =C(O2)P(T) P(O2)------氧分压 C(O2)------气相中氧摩尔分率 P(T) ------总压力 校准：操作压力下校准 4 校准： 零点：不含氧气的气体通入发酵罐（灭菌后进行） 满刻度：发酵罐大量充气搅拌，操作温度下进行
由于细菌很小，且酵母菌和霉菌不能形成离散的细胞， 因此要精确测定细胞数比较困难。
二 测定细胞重量
1 细胞干重称量法：
直接测定单位体积培养物的细胞干重，以代表菌体细胞物质总量的生长。 --直接可靠，较适用于丝状菌的生长测定。 --必须清除非细胞固体物质。若存在大量碳酸钙，纤维素等在细胞洗涤 时难以除去的物质，应尽量在细胞重量比杂质重量大得多的条件下测定。
图6-3 可灭菌的pH电极的典型设计
图6-4
图6-5 组合pH电极中不同来源的电位
E=E0+RT/F㏑(αH+)
E:测量电位 E0：标准电极电位
E=E0 –K[pH-pH0]
零点校准：标准缓冲液 pH=7， K由另外一种标准缓冲液确定 pH与温度有关系，电极内有铂电阻温度计自动补偿体系
二 pH传感器的使用 1 传感器的使用
* 膜需要很薄，响应性好，但必须具有强度耐受灭菌
c) 膜覆盖溶氧电极的操作原理： 氧专一性透过 ，电极产生的电流与液体介质中氧 分压成正比，并且假定：
--膜表面的氧分压与液体分压相同（液体混合良好） --膜和阴极间的电解质层厚度忽略不计 --扩散是单向，即垂直于电极表面
--电极的电流输出与阴极表面的氧流量成比例
3 超声波传感器：泡沫可以吸收25-40Hz的波长（）
4 转盘式泡沫传感器： 旋转阻力的增加，同时可以机械破碎泡沫
六 发酵液液量(略) 和液位检测
液位检测：压差法（常用） 七 尾气分析 1 色谱仪（HPLC) 2 质谱仪（MS）：见图6-11。
对挥发的重要的代谢产物实时检测, O2,CO2,N2,H2,CH4,H2S及挥发成分，如：乙醇，3-羟基丁酮，丁二醇， 羧酸等的分析
2 电极的选择： a) 电流输出大，与溶氧成线性 b) 稳定性好 c) 响应迅速,与液体温度无关 d) 残留电流小（零级溶氧电流） e) 机械强度大，对co2渗透少 二 电极的制备和安装
a) 膜： 10-40µm 聚四氟乙烯 易损坏或结垢，出现漂移或响应滞后 安装或更换： 膜与电极无气泡，见图6-9
原理：毛细管或膜入口—真空区碰撞电离—磁场分离—检测-分析
图6-11磁偏转原理示意
第七节 生物传感器在发酵过程检测中的应用（略）