荧光蛋白研究进展

荧光蛋白研究进展
赵嫚
学院：理学院班级：应化0803班学号：2008310203907
摘要：凭借在绿色荧光蛋白质(GFP)研究领域取得的重要成就，3 位科学家获
得了今年的诺贝尔化学奖，他们分别是马丁·查尔菲、钱永健和下村修。

绿色荧光蛋白质可以帮助科学家了解细胞机制如何工作。

利用转基因技术，所有细胞和动物都可以产生荧光蛋白质。

康涅狄格学院化学家、《发光基因》作者马克·齐默将绿色荧光蛋白质称之为“21 世纪的显微镜”。

通过让基因携带绿色荧光蛋白质——与瘤转移或大脑功能有关的基因——科学家只需通过寻找荧光便可知
道基因何时以及为什么“开启”。

本文就GFP的发现历程、生化特性、及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。

关键词:荧光蛋白质 GFP 诺贝尔化学奖研究前景
1、荧光蛋白质简介
荧光蛋白质为从发光生物中分离出的发光性蛋白质。

它不是虫荧光素、虫荧光酶那种酶蛋白质催化所引起的发光，而是通过低分子物质催化而发光的蛋白质。

水母的发光蛋白质（aequorin）是通过Ca2+而发光的。

海仙人掌类的Renilla也含有同样的发光蛋白质。

这种物质包含在细胞内颗粒中，这种颗粒称发光小体（lumisome），发光蛋白质所包含的发光物体是与海荧虫荧光素极为相近的物质，因而推测，发光蛋白质的发光与虫荧光素、虫荧光素酶反应有着密切的关系。

自1992 年绿色荧光蛋白基因从水母体内克隆以来，现在已经从很多的海洋生物物种中克隆到了新的荧光蛋白，它们能特异地“点亮”生物分子或细胞，并显示出生物分子的活动情况，从而能更有助于我们揭示这些分子或细胞的活动规律及本质。

已报道的荧光蛋白光谱分布于整个可见光区，它们被广泛应用于基因的表达调控、蛋白质空间定位与转运、蛋白折叠、信号传导、蛋白酶活性分析、生物分子相互作用等研究领域，荧光蛋白的发现与应用为现代生物学的研究提供了强有力的研究手段。

日籍科学家下村修（Osamu Shimomura）首次从水母(Aequorea victoria) 中分离出绿色荧光蛋白(green fluorescent protein，GFP)，美籍教授查尔菲（Martin Chalfie）首次将GFP 的cDNA 转到新的物种中表达。

美籍华裔科学家钱永健（Roger Y. Tsien）率先阐述了GFP 发光的化学机制，并于1995 年通过单点突变(S65T) 技术获得了荧光强度和光稳定性大大增强的GFP 突变体(GFP-S65T)。

Tsien 研究组基于GFP，进一步突变出了蓝色荧光蛋白(blue fluorescent protein，BFP)、青色荧光蛋白(cyan fluorescent protein，CFP) 和黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein，YFP)。

后来，研究人员又从珊瑚和海葵等物种中克隆出光谱红移的荧光蛋白，极大地扩展了荧光蛋白的多色成像应用。

近几年来，科学家巧妙地将光活化与光转换荧光蛋白应用于高分辨成像，
突破光学衍射极限，分辨率达到几十纳米，这是显微成像技术史上的一次革命性的飞跃。

这三位科学家因在发现和研究绿色荧光蛋白方面做出贡献而分享了2008年的诺贝尔化学奖。

他们的工作不但在科学上对化学、生物学、医学等领域具有重要的意义，而且也与人们的日常生活密切相关，对于提高人类的生活品质以及进一步改善人类的健康有十分重要的意义。

2、研究GFP的时间线索
GFP从最初被发现到今天广为应用，经历了半个多世纪的时间。

首先简单回顾一下这半个多世纪内和GFP相关的主要事件。

1955年人们首次注意到水母体内的绿色荧光物质。

1962年下村修从维多利亚多管水母中提取并分离了GFP，证实了绿色荧光物质是一种蛋白质。

它的溶液在日光下略呈绿色，在白炽灯下略显黄色，而在紫外灯下则发出强烈的绿色荧光。

1969年之前称为绿色蛋白质（green protein）得名“绿色荧光蛋白”。

1974年研究发现光蛋白和GFP两种分子之间会发生能量转移。

1979 年下村修找到了GFP 中的生色基团（Chromophore）
1985年普腊石（Douglas Prasher）根据蛋白质的氨基酸顺序拿到了光蛋白（水母素）的基因。

1992年普腊石拿到了GFP的基因。

1993年GFP中生色基团的结构被确认。

1994年沙尔菲通过大肠杆菌和线虫研究获得了GFP的生色机理；是年，第一种蓝色荧光蛋白被报道，并提到了它可用于荧光共振能量转移（FRET）实验中。

1995 年研制出了增强型绿色荧光蛋白（EGFP），它的转录速度比野生GFP 快四倍。

1996年得到了野生GFP和EGFP的晶体结构，钱永健在EGFP的基础上，利用突变技术，设计并研制出黄色荧光蛋白。

1997年光蛋白和GFP被用于Ca2+的敏感指示剂。

1999年后各种各样的荧光蛋白被发明、改造并用于科学研究。

在研究GFP的50多年间， 2008年诺贝尔化学奖的三位得主做出了至关重要的贡献。

3、GFP的生化性质
1962年，Shimomura O等首次从多管水母属(Aequorea victoria)中分离纯化出了GFP，随后人们对GFP进行了广泛研究，目前研究得较为深入的是来自多管水母科(Aequorea)和海紫罗兰科(Renilla)的荧光蛋白，即A—GFP和R—GFP。

A—GFP 是分子质量为27 ku～30 ku的蛋白单体，R—GFP是分子质量为54 ku的同型二聚体，二者都是酸性球状蛋白质，氨基酸组成相似，发射光谱基本相同，但激发光谱不同。

A—GFP在395 nm和470 nm具有吸收高峰，R—GFP在498 nm具有强烈的光吸收。

只有完整的GFP分子才会产生生物荧光，但与荧光的产生直接有关的是GFP 分子中一小段被称为色基(Chromophore)的部位。

GFP用作标记蛋白，具有以下优点：①荧光稳定。

GFP对光漂白有较强的耐受性，能耐受长时间的光照；GFP在pH 7～12范围内也能正常发光；对高温(70℃)、碱性、除垢剂、盐、有机溶剂和大多数普通酶(链霉蛋白酶Pronase除外)都有较强
抗性。

②检测方便。

用荧光显微镜或肉眼就可以观察到，且可进行活体观察，不会损伤正在生长的细胞和组织；③无种属特异性，也没有细胞种类和位置的限制，Chalfie M等用PCR方法扩增GFP cDNA后，克隆到原核表达载体上，转化大肠埃希菌，经IPTG诱导后，在紫外光照射下转化细菌能发出绿色荧光；④GFP对受体细胞基本无毒害；⑤不受假阳性干扰。

由于其他生物本身不含有GFP，因此不会出现假阳性结果，GFP作为分子探针可以代替荧光染料避免由于染料扩散造成的定位不准，使结果真实可靠；⑥不需任何反应底物和辅助因子；⑦可制成永久标本。

GFP的荧光可以耐受光漂白，也可耐受福尔马林的固定，因而可制成长期保存的标本；⑧灵敏度高。

GFP标记方法比免疫组织化学方法具有更高的灵敏度和分辨率。

尽管GFP基因作为报告基因或分子探针有许多优点，但野生型GFP发光较弱，其次荧光反应不是酶反应，不能通过添加某些物质来加强信号，且不易对荧光进行定量检测。

另一方面，GFP基因在植物细胞内的表达频率并不高，甚至在某些植物细胞中并不表达。

4、GFP的应用前景
GFP分子质量小，能够在异源细胞中稳定表达并发射荧光，不需要任何辅助因子参加，对细胞没有毒性，因而得到广泛应用。

3．1 作为报告基因构建基因工程载体
常用的质粒克隆载体的报告基因如LacZ，是利用酶促催化反应，需要加人外源底物和诱导物(如IPTG，X—gal)，不仅操作繁琐且价格昂贵。

现已构建了以GFP S65T基因作为筛选标记的新型克隆载体，建立了以绿白斑筛选法筛选阳性重组子的新方法，替代LacZ蓝白斑筛选，不需X—gal，经济，简单可行。

3．2 目的基因的功能研究
将目的基因与GFP基因连接后，通过观测融合蛋白的荧光特性研究其表达和功能。

哺乳动物细胞表达两种DNA拓扑酶，该酶的N末端和中部结构域序列高度保守，而其C末端结构域(C—terminal-domain，CTD)具有种属特异性。

为了确定体内核定位是否仅有CTD参与就可完成，将C末端基因与GFP基因连接，并在GALl启动子驱使下在酵母细胞中表达。

通过检测GFP信号，发现两种拓扑酶的CTD均得到表达，而且拓扑酶Ⅱ-GFP仅在细胞的有丝分裂期发现，拓扑酶Ⅱ-GFP主要出现于细胞分裂间期，结果说明拓扑酶的CTD即足以充当核定位的信号。

3．3蛋白质缔合作用研究
Hale C A等利用GFP标记，研究了可溶性微管蛋白FtsZ与其内膜受体ZipA问的缔合作用，他们将GFP与ZipA融合，并用FtsZ与之直接结合，通过荧光检测发现，ZipA—GFP融合蛋白在细胞壁缢缩前和缢缩过程中均位于FtsZ与膜相关的特殊环中，说明ZipA—FtsZ的相互缔合是细胞分裂必需的。

ZipA可能直接参与FtsZ 环的形成和功能。

3．4 病原体与宿主关系的研究
将病原体用GFP活体标记，可以在全真条件而不是模拟条件下实时研究病原体与宿主的关系。

将GFP基因插人基因组，体外转录获得感染性RNA，并以之接种
烟叶，观察发现在接种点和整个植株均可表达GFP。

持续观察GFP的出现情况，发现整株感染时TMV以两种方式运动：①细胞间慢的传播，伴随病毒复制的GFP表达；
②维管介导的快速转运，病毒不复制，GFP不表达。

3．5 GFP在生态学中的应用
将GFP基因直接导入目标生物或将GFP基因克隆到病毒、细菌或质粒上，通过它们的介导而间接标记目标生物，进行生态学规律研究。

用GFP基因标记遗传工程微生物以监测其在水环境中的存活和去向。

朱应等构建了带GFP基因的重组棉铃虫病毒。

该病毒一次感染棉铃虫后不再重复感染，室内饲养3代，各代均可见典型的发绿色荧光的棉铃虫，表明病毒可以介导GFP标记其宿主，预计将为研究棉铃虫的迁飞和暴发规律提供强有力的手段。

3．6 GFP在生物防治中的应用
目前生物农药的杀虫效果往往得不到准确评估。

利用GFP标记，通过荧光观察可以避免评估杀虫剂杀虫效果时仅仅记录有典型感染症状的害虫个体，而忽视无明显感染症状但确实已经感染或正在感染的害虫个体，同时无需进行分子生物学鉴定即可方便地区分杀虫剂致死和天然病原致死，从而客观准确地评价杀虫剂的毒力。

3．7 GFP作为一种新型免疫标记物的探索
利用GFP的发光特性使免疫反应呈绿色荧光从而可以直接观察，可望取代传统的标记技术，建立特异、灵敏、简便和快速的免疫诊断新方法。

现已将GFP基因与猪圆环病毒的特定基因相连，进行核酸定位，也成功地实现了GFP基因与HBVe Ag基因融合后在大肠埃希菌和昆虫细胞中高效表达，得到既能发射荧光又具有抗原性的双功能融合蛋白，为获得一种新型发光免疫诊断试剂奠定了基础。

5、问题及展望
尽管GFP能在蓝光或长紫外光的激发下，不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光，但是检测GFP基因转化材料时，如果背景荧光太强，荧光信号可能被背景信号所遮盖，就很难检测到荧光信号。

在植物中，叶绿体和细胞壁是主要的自发荧光源，是构成检测荧光信号的主要障碍。

在自发荧光较弱的情况下，通过调整光圈减少进光量或选择合适的滤光片就可以消除它们，从而突出GFP荧光。

随着分子生物学理论与技术的发展，对GFP的理论研究进一步深入，并且GFP 在分子生物学领域的应用进一步加强，GFP工程，包括GFP蛋白工程和GFP基因工程的迅速发展，尤其GFP基因作为新型报告基因越来越受到关注，目前已经应用GFP作为选择标记基因成功构建多种表达外源基因的重组质粒。

但是在试验过程中也发现一些因素影响着GFP的检测。

另外，在细胞生物学的研究过程中发现新生GFP通过折叠和加工成为具有活性的形式过程十分缓慢。

但随着生物技术的发展，对GFP的基础理论研究的进一步深入和新型突变体的不断出现，有理由相信这些问题终将得到解决，从而使GFP更好地为科学研究服务。

此外，新型光学成像技术(如飞秒激光快速随机扫描双光子显微成像、高分辨光声成像、超分辨显微成像等) 都迫切需要具备新特性的荧光分子与之相结合，以更大程度地提高成像的时空分辨率和检测灵敏度。

我们有理由相信，荧光
蛋白在今后的生物学研究中能发挥更为重要的作用。

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