花青素的提取

生化实验报告———————————————————————————

山楂原花色素的提取

一实验目的

1.了解并掌握从山楂中制备原花色素的方法。

二实验原理

原花色素（也称原花青素）（proanthocyanidins）是一类从植物中分离得到的在热酸条件下能产生花色素的多酚化合物。它既存在于多种水果的皮、核和果肉中，如葡萄、苹果、山楂等。也存在于如黒荆树、马尾松、思茅松、落叶松等的皮和叶中。

原花色素属于生物类黄酮（flavonoids），它们是由不同数量的儿茶素或表儿茶素聚合而成，最简单的原花色素是儿茶素的二聚体，此外还有三聚体，四聚体等。依据聚合度的大小，通常将二至四聚体称为低聚体，而五聚体以上的称为高聚体。从植物中提取原花色素的方法一般有两种，分别是用水抽提或用乙醇抽提。其抽提物为低聚物，称之为低聚原花色素（oligometic proanthocyanidins，简称OPC）。

生理功用：

1.最好的心脏保护剂，抵御引发心血管疾病的诱变因素的冲击。

2.强化血管，有消肿化瘀的功效。减少毛细血管的阻力和改善渗透性，使细胞更容易吸收养分与排除废物。

3.高效抗氧化能力。清除氧自由基的能力比其他天然抗氧化剂如胡萝卜素、维生素C和E、儿茶素等强很多。

4.产生组胺的抑制剂，减轻炎症。抗过敏皮肤保健、抗衰老。

利用低聚原花青素溶于水的特点，用热水煮沸抽提原花青素，再用大孔吸附树脂吸附、洗脱得到原花青素。

D-101树脂是一种球状、苯乙烯型、非极性交联聚合物吸附剂，具有相当大的比表面积和适当的孔径，对皂苷类、黄酮类、生物碱等物质有特殊的选择性，适用于从水溶液中提取类似性质的有机物质。

三实验器材

1. 新鲜山楂（或山楂片），市售。

2. 烧杯。

3. 高速组织粉碎机。

4. 玻璃层析柱1.5cm*20cm。

5. 大孔吸附树脂D-101。

6.电磁炉。

7. 不锈钢锅。

8.双层纱布。

四实验试剂

1、95%乙醇（实验室提供）。

2、60%乙醇：取95%乙醇60ml，加入蒸馏水，使体积达到95ml。

五实验操作

1.称取山楂干6.00g，剪成块状，置于锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，沸水浴45min，间期混匀。冷却后加入20ml蒸馏水，用脱脂棉或双层纱布过滤，滤液备用。

2.取一根层析柱（1.5cm*20cm），洗净，竖直装好，关闭出口，加入蒸馏水约1cm 高，用烧杯取一定量已处理好的大孔吸附树脂D-101，搅匀，沿管内壁缓慢加入，待柱底沉积约1cm高时，缓慢打开出口，继续装柱至高度12cm（液面高于树脂3~4cm）。

3.平衡：用蒸馏水洗2倍柱床体积（~20ml），控制流速在2ml/min左右，至流出液pH值显中性。

4.滤液上样，上完样后，先用蒸馏水洗2倍柱床体积，然后换60%乙醇进行洗脱，控制流速在1ml/min。待有红色液体流出后开始收集，直到收集到无红色为止。

5.将洗脱液用60%乙醇定容至100ml，贴好标签后置于4摄氏度冰箱中，留待下次实验。

六注意事项

1、实验前应检查层析柱是否完好，有无堵塞或漏气现象。

2、装柱要求连续、均匀、没有气泡和断纹，液面不得低于树脂表面，否则需重

新装柱。

3、洗脱时流速不宜过快。

七实验记录

取用山楂干质量：6.07g

原花色素的测定

一实验目的

1.掌握盐酸-正丁醇比色法测定原花色素的院里和方法。

二实验原理

紫外分光光度法：利用原花色素在波长280nm处具有最大吸收的特点。该方法简便易行，但提取物成分多样，标准难定。

香草醛检测法：原花色素在酸性条件下，其组成单元儿茶素的A环上的羟基和香草醛发生缩合反应，在浓酸作用下形成的产物变为有色的正离子。

铁盐催化比色法；薄层层析法；HPLC法；HPLC-MS质谱法

原花色素（I）的4~8连接键很不稳定，易在酸作用下打开。反应过程（以二聚原花色素为例）是：在质子进攻下单元C8（D）生成碳正离子（II），4~8键裂开，下部单元形成（-）-表儿茶素（III），上部单元成为碳正离子（IV），失去一个质子成为黄-3-烯-醇（V），在有氧条件下失去C2上的氢，被氧化成花色素（VI），反应还生成相应的醚（VII）。若采用正丁醇溶剂可防止醚的形成。

三实验器材

1. 试管1.5cm*15cm（*9）。

2. 烧杯、量筒。

3. 722型分光光度计。

4. 吸管。

5. 电磁炉。

6. 不锈钢锅。

四实验试剂

1、1mg/ml原花色素标准品：准确称取10.0mg原花色素标准品用甲醇溶解，于10.0ml容量瓶定容至刻度。

2、HCl-正丁醇：取5.0ml浓HCl加入95.0ml正丁醇中混匀即可。

3、2%硫酸铁铵：称取2.0mg硫酸铁铵溶于100.0ml 2.0mol/L HCl中。

4、试样溶液：上次实验配制得到（1.0~3.0mg/ml）。

五实验操作

管号试剂/ml 0 1 2 3 4 5 6 7

样品

8

样品

OPC标准

液

0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.1 0.2

甲醇0.5 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 0.20 0.4 0.3 2%硫酸

铁铵

0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 HCl-正丁

醇

3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40 3.40

沸水浴20min取出，冷水冷却15min后测定

OPC含量

/μg

0 50 100 150 200 250 300

A546nm0 0.171 0.383 0.451 0.410 0.676 0.633 0.382 0.509 六数据处理

1、以标准OPC含量（μg）为横坐标，A546nm吸光度为纵坐标绘制标准曲线。由样品的吸光度查算出样品液的OPC含量。

2、由收集液的体积和所测浓度计算山楂中的OPC百分含量。