天麻小菇属萌发菌生产技术

天麻小菇属萌发菌生产技术

天麻又名神草、仙仙根、定风草、离合草、仙人脚、鬼督邮、还筒子、赤箭、离母、四龙子、鬼箭杆、盗人脚、山萝卜、水洋芋, 其地下球茎是我国名贵的传统中药。兰科天麻属,多年生草本植物,无根、无绿色叶片,在其生活史中大部分时间在地下度过, 既不能从土壤中吸收无机矿物元素, 也不能进行光合作用自养生活, 其生长发育所需营养主要依靠同化侵入其体内的一些真菌而获得。种子需要同化小菇属等真菌才能获得营养而发芽, 发芽后形成的球茎又必须同化蜜环菌才能正常生长发育形成成体球茎（箭麻）[1] 。从目前已用于生产的萌发菌看, 萌发菌为弱腐生菌, 培养条件苛刻、技术要求较高, 一般由专业生产厂提供。现将萌发菌生产技术介绍如下。

1生活特性

到目前为止, 文献报道的可促使天麻种子发芽的真菌有12 种, 用于生产的萌发菌均属于小菇属真菌, 其生活特性如下。

1.1 腐生为主, 兼性寄生萌发菌对树叶中的纤维素有强烈的分解和消化能力, 多腐生于高山林间落叶上。当天麻种子落入感染了萌发菌的树叶上时, 萌发菌又可侵入具有生命力的天麻种子。因此, 萌发菌主要营腐生生活, 但也有兼性寄生的特性。

1.2萌发菌生长对空气的要求

在自然条件下, 主要分布在枯枝落叶层及疏松的表层土壤中。

在培养过程中如果培养料装得太多或瓶盖太紧, 菌丝生活力减弱甚至死亡。说明萌发菌是一类好气性真菌, 需要有足够的氧气才能正常的生长发育。

1.3萌发菌生长对温度的要求

在自然条件下,萌发菌子实体一般在夏季出现, 说明其菌丝生长需要有较高的温度。试验表明，萌发菌在15〜30C温度范围内均能生长，以25C时菌丝生长为最快，低于20C或高于28C菌丝生长速度明显减漫，高于30C以上24h,菌丝将失去生活力，甚至死亡。

1.4萌发菌生长对基质含水量的要求

在自然条件下, 萌发菌多生长在湿度较高的环境中。试验结果表明, 不同的萌发菌对水分的要求不同, 但都喜欢生长在基质含水量在1 00%〜200%的高湿环境中, 基质含水量过高和过低都会导致菌丝生长速度减缓, 甚至停止生长。

1.5萌发菌生长对基质酸度的要求

在自然条件下, 萌发菌常生长在中性及偏酸性环境。试验结果表明，萌发菌菌丝在pH值4.5〜7.0均能生长，以pH值5.0〜

5.5最适宜, 碱性条件不利于菌丝生长。

2萌发菌的分离与鉴定

2.1 菌种的分离

萌发菌通常分布在山区较为潮湿的枯枝落叶上, 不像蜜环菌那样有独特的菌索, 一般不能直接用肉眼识别。因此,用于分离萌发菌的材料十分有限。如果在没有人为使用萌发菌的情况下, 天麻种

子能在树叶上萌发形成原球茎, 说明这树叶上肯定有萌发菌选取这些树叶或原球茎作为分离材料（最好选原球茎）, 从中分离出萌发菌。具体方法是:在天麻种子成熟季节, 从山区林下收集潮湿的树叶,洗去泥土后,放入木箱、花盆等容器中,撒上天麻种子, 盖上塑料窗纱,再撒1层树叶后盖上沙土。2个月后观察是否有天麻种子萌发。若有, 则可取出原球茎并作为萌发菌的分离材料。取出的原球茎先用清水洗净, 于无菌室中用0.1%升汞水中浸泡1min,再用无菌水冲洗3〜4次,最后用灭过菌的滤纸吸去表面的水后切成小块，分开放入事先准备好的PDA平面培养基中培养，待原球茎小块处长出白色菌落后, 进行菌种的纯化。经纯化获得单一菌株后进行鉴定。

2.2 菌种鉴定

在生产上, 萌发菌鉴定最简便和实用的办法是进行天麻种子发芽试验, 即将经分离所得菌种拌播天麻种子, 试验其发芽情况。萌发菌大多分布在山区较为潮湿的枯枝落叶上, 说明枯枝落叶是萌发菌良好的培养基质, 但从现有萌发菌的试验结果看, 树叶、玉米芯、棉子壳、麸皮等都可作为培养基。为方便后续发芽试验, 最好选用树叶作为培养基。具体方法如下:

用250mL的锥形瓶装上用水浸泡并洗净的树叶，稍加压紧，叶形较大的落叶可适当剪小。然后进行高压灭菌, 在无菌室将斜面培养基的菌连同培养基挑取一块,转接在树叶培养基中, 在25C下培养，菌丝长满后即可进行发芽试验。做种子发芽试验时, 先在直径约

10cm的培养皿底部垫1层薄的海绵，加入适量的水以保持潮湿, 然后将已长满菌的树叶放在海绵上, 再将天麻种子播撒在菌叶上。在25C下培养,3周以后用放大镜观察。也可以用50mL的扁平克氏瓶，底部放海绵，加入适量水，上层放用水浸泡并洗净的树叶, 高度达到瓶高的2/3, 经高压灭菌后, 接菌, 待菌丝基本长满树叶后, 在树叶和瓶壁上撒一些种子, 通过瓶壁可观察到树叶上种子萌发的动态。

天麻种子只有1 层薄薄的种皮, 播种时消毒容易伤胚。

主要采取以下2种方法避免杂菌污染。一是当天麻果实即将开裂而未开裂时, 将果实剪下。在无菌室中, 先切去顶端残存的花冠, 用25%酒精擦洗表面消毒, 再挑取其中的种子播在有菌树叶之上。二是将未作任何消毒的种子, 直接播在菌叶之上。但是叶面必须长满菌, 使其占生长优势, 这样种子带上的一些杂菌也不能生长, 也能达到较好的效果。如果在所分离的菌种中有可使天麻种子发芽且情况满意的菌种, 生产上就可以对其进行扩繁, 以准备天麻种植时用。同时, 有必要对其进行进一步鉴定, 以确定该菌种是否为一种新的菌种。

3萌发菌的培养

3.1 一级菌种的培养

在天麻种子萌发试验中得到肯定结果并准备用于天麻生产

的菌种,可在无菌条件下将其转接于PDA培养基上进行扩繁，在22〜25 C温度下避光培养，当菌丝在培养基上生长至2/3或基本长满培养基表面时, 即可用于生产二级菌种。

3.2二级菌种的培养

在无菌条件下, 将培养好的一级菌种转接于已灭菌的二级固体、半固体或液体菌种培养基上，在25C恒温避光条件下培养，菌丝长满整个培养基后, 所得菌种即为二级菌种。

3.3三级菌种（生产种）的培养将培养好的二级菌种转接

于三级菌种培养基上, 菌丝长满后

即得三级菌种。三级菌种可用于伴播天麻种子, 进行天麻有性繁殖播种。