流式细胞术原理与应用简介

FCM测量数据的存贮,显示和分析
目前 目前FCM所采用的都是多参数指标,荧光 所采用的都是多参数指标, 所采用的都是多参数指标 参数标记物最多可达4个 参数标记物最多可达 个,数据的存贮采用 列表排队方式,可节省存贮空间. 列表排队方式,可节省存贮空间. 数据文件为二进制文件,缺乏直观性,数 数据文件为二进制文件,缺乏直观性, 据的显示常用以下几种方式: 据的显示常用以下几种方式:
流动室与液流驱动系统
激光光源及光束成形系统
目前台式机 目前台式机FCM,大多采用氩离子气体激 , 光器. 光器. 激光光束在到达流动室前,先经过透镜聚 激光光束在到达流动室前, 形成约22× 的光斑, 焦,形成约 ×66m的光斑,这样激光能 的光斑 量较强,以激发荧光染料. 量较强,以激发荧光染料. 台式机的整个光路是封闭的,在安装时由 台式机的整个光路是封闭的, 工程师调试完毕后,无需用户作任何调节, 工程师调试完毕后,无需用户作任何调节, 使用十分方便. 使用十分方便.
– – – – – 流动室及液流驱动系统 激光光源及光束成形系统 光学系统 信号检测与存贮,显示, 信号检测与存贮,显示,分析系统 细胞分选及浓缩系统
流式细胞术 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM) ,
图示如下页: 图示如下页:
流式细胞仪构造模式图
流式细胞仪构造示意图
流动室与液流驱动系统
流式细胞术发展史
1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理, 年 应用分层鞘流原理, 应用分层鞘流原理 成功设计红细胞光学自动计数器 1969年Van Dilla及其同事在 及其同事在Los Alamos, 年 及其同事在 NM发明第一台荧光检测细胞计 发明第一台荧光 发明第一台荧光检测细胞计 1972年Herzenberg研制出细胞分选器 研制出细胞分选 年 研制出细胞分选器 1975年Kohler等提出单克隆抗体技术,为 等提出单克隆抗体技术, 年 等提出单克隆抗体技术 细胞研究提供大量的特异免疫试剂 大量厂家不断生产流式细胞仪
淋巴细胞和单核细胞的活化 细胞因子的研究 淋巴细胞的增殖 树突状细胞的研究
细胞功能
细胞表面/胞浆/ 细胞表面/胞浆/核的 特异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体
FCM的临床应用
HIV免疫分型,CD4绝对计数 免疫分型, 免疫分型 绝对计数 白血病和淋巴瘤的免疫分型 肿瘤的细胞周期和倍体分析 网织红细胞计数 细胞移植的交叉配型和免疫状态监测 干细胞计数 残量白血病细胞检查 HLA-B27检查 检查 血小板功能及相关疾病
散射光信号波长与激光相同. 散射光信号波长与激光相同.
散射光信号示意图
Right Angle Light Detector α Cell Complexity
Incident Light Source
Forward Light Detector α Cell Surface Area
荧光信号
一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的 一种是细胞自身在激光照射下发出微弱的 荧光信号, 自发荧光. 荧光信号,称自发荧光. 一种是经过特异荧光素标记后,受激发光 一种是经过特异荧光素标记后, 照射得到的荧光信号, 照射得到的荧光信号,通过对这类荧光信 号的检测和定量就能了解所研究细胞参数 的存在与定量. 的存在与定量.
凋亡相关蛋白: 凋亡相关蛋白:
Fas Bcl-2
细胞凋亡—PI分析
调亡细胞 正常G0/G1期细胞 期细胞 正常
Events PI - Fluorescence
细胞凋亡—Active Caspases-3
细胞凋亡—Caspases-3
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡—Annexin V
细胞凋亡分析
细胞凋亡与细胞坏死是两个不同的过程 细胞凋亡的主要检查手段
形态学检测 Ladders实验 实验 流式细胞术检测
与凋亡相关的病理过程
HIV 自身免疫性疾病 肿瘤
细胞凋亡分析
细胞凋亡的主要指标
细胞内酶改变:Caspase-3活化 细胞内酶改变: 活化 细胞膜不对称性改变,磷脂酰丝氨酸外翻, 细胞膜不对称性改变,磷脂酰丝氨酸外翻, 但仍然保持膜的完整性: 但仍然保持膜的完整性:Annexin V/PI 细胞核 细胞核DNA的断裂改变:TUNNEL实验( 的断裂改变: 实验( 的断裂改变 实验 APO-BRDU,APO-DIRECT) , )
流式细胞术发展史
目前国内主要流式细胞仪厂家: 目前国内主要流式细胞仪厂家:
– Beckton Dickinson(BD)公司 公司 – BACKMAN COULTER公司 公司
流式细胞仪构造
流式细胞仪 流式细胞仪(Flow Cytometer,FCM)的结构 , 的结构 分五部分: 分五部分:
பைடு நூலகம்
细胞凋亡—BrdU
FCM的应用——免疫学
淋巴细胞免疫分型
淋巴细胞亚群分析 CD4绝对计数 绝对计数
HIV的诊断与研究 的诊断与研究
淋巴细胞 CD4/CD8分析 分析 CD4绝对计数 绝对计数 T细胞活化 细胞活化
细胞移植的交叉配型和免疫状态监测
FCM的免疫学应用
免疫功能和免疫调控的研究
– – – – – 直方图 散点图 等高线图 密度图 三维图
直方图
直方图 直方图(Distribution Histogram)
– 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度, 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度, 单位是道数,可以是线性或对数坐标. 单位是道数,可以是线性或对数坐标. – 纵坐标一般是细胞数. 纵坐标一般是细胞数.
增殖状态分析: 增殖状态分析:
反映了肿瘤的生长速度和侵袭性
正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT)
多发性骨髓瘤
FCM在肿瘤早期诊断和鉴别诊断中的作用
DNA非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌 非整倍体的出现可能是癌前病变发生早期癌 变的一个重要标志 在病理形态学不能做出诊断前可提供确切诊断信 息 DNA非整倍体的交界瘤应按恶性对待 非整倍体的交界瘤应按恶性对待 形态学表现良性的肿瘤出现非整倍体提示恶变可 能 DNA指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助 指数可作为判断间叶组织肿瘤良恶性的辅助 指标
荧光信号示意图
散射光信号
散射光信号不依赖任何样品的制备技术 如染色),因此称为细胞的物理参数. ),因此称为细胞的物理参数 (如染色),因此称为细胞的物理参数.
– 前向散射角(Forward Scatter,FSC):与细胞 前向散射角 , : 的大小有关, 应用中, 作阈值, 的大小有关,在FCM应用中,常取 应用中 常取FSC作阈值, 作阈值 来排除样品中的各种碎片. 来排除样品中的各种碎片. – 侧向散射角 侧向散射角(Side Scatter,SSC):与激光束正 , : 度的散射光信号, 交90度的散射光信号,与细胞粒度及复杂程度 度的散射光信号 正相关. 正相关.
DNA分析 DNA分析
s
细 胞 数 量
G0G1
s
0 200 400 600
G2 M
800 1000
2N
4N
DNA分析的临床意义
DNA分析诊断肿瘤 分析诊断肿瘤
– DNA非整倍体细胞峰 非整倍体细胞峰 – 突出的四倍体细胞峰 – SPF>15%
DNA倍体分析: 倍体分析: 倍体分析
结合临床病理的形态学诊断, 结合临床病理的形态学诊断,对一些恶性肿瘤进行早期诊 跟踪随访和早期治疗, 断,跟踪随访和早期治疗,大大提高一些肿瘤的治愈率和 生存率.尤其对一些细胞抽吸物,体液, 生存率.尤其对一些细胞抽吸物,体液,组织液的脱落细 胞的分析,意义尤为重要. 胞的分析,意义尤为重要.
流式细胞术
原理与应用简介
湖北中医学院中医药实验中心 田代志
流式细胞术发展史
1930年Caspersson和Thorell开始致力于细 年 开始致力于细 和 开始致力于 胞计数的研究 胞计数的研究 1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化, 最早设想细胞检测自动化, 年 最早设想细胞检测自动化 用光电仪记录流过一根毛细管 毛细管的细胞 用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记 提出结合荧光素 年 提出结合荧光素的抗体去标记 细胞内的特定蛋白 1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计 申请了在悬液中计 年 申请了在 数粒子的方法的专利 数粒子的方法的专利 1950年Caspersson用显微 用显微UV-VIS检测细胞 年 用显微 检测细胞
散点图
散点图 散点图(Dot Plot)
– X坐标为该细胞一参数相对含量,Y坐标为该细 坐标为该细胞一参数相对含量, 坐标为该细 坐标为该细胞一参数相对含量 胞另一参数的含量,可以将细胞亚群分开. 胞另一参数的含量,可以将细胞亚群分开.
等高线图和密度图
三维图
设门分析
可以通过设"门" 可以通过设" (Gate),分析,分 ,分析, 选感兴趣的细胞. 选感兴趣的细胞.
流动室是仪器核心部件,被测样品在此与激光相 流动室是仪器核心部件, 是仪器核心部件 交. 流动室由石英玻璃制成,中央有一长方形小孔, 流动室由石英玻璃制成,中央有一长方形小孔, 供单个细胞通过. 供单个细胞通过. 流动室内充满了鞘液,其作用是将样品环形包绕. 流动室内充满了鞘液,其作用是将样品环形包绕. 鞘液流速稳定,样品流在鞘流的环包下形成流体 鞘液流速稳定,样品流在鞘流的环包下形成流体 动力学聚焦,从而得到准确的细胞荧光信息. 动力学聚焦,从而得到准确的细胞荧光信息. 流动室上装有压电晶体,受到振荡信号可发生振 流动室上装有压电晶体, 动.
FCM的分辨率
分辨率是衡量 分辨率是衡量FCM测量精度的指标,通常 测量精度的指标, 测量精度的指标 用变异系数CV表示 表示. 用变异系数 表示. 一般要求 一般要求CV<8,最好 ,最好CV<3. .
FCM图片——台式机
FCM图片——大型机
FCM的检测范围
细胞结构
细胞大小 细胞粒度 细胞表面面积 核浆比例 DNA含量与细胞周期 含量与细胞周期 RNA含量 含量 蛋白质含量
激光光源及光束成形系统
光学系统
FCM的光学系统由若干组透镜,滤光片和 的光学系统由若干组透镜, 的光学系统由若干组透镜 小孔组成, 小孔组成,它们将不同波长的荧光信号分 别送入到不同的电子测控器. 别送入到不同的电子测控器. 主要光学原件:滤光片 主要光学原件:滤光片(Filter)
– 长通滤片 Long Pass Filter, LP – 短通滤片 Short Pass Filter, SP – 带通滤片 Band Pass Filter, BP
常用荧光染料
目前台式机 目前台式机FCM配置 配置 – 488nm激光管常用染料有 激光管常用染料有 PI (Propidium Iodide) PE (Phycorey- thrin) FITC (Fluorescein Isothiocyanate) PerCP (Peridinin Chlorophyll Protein) PE-CY5等 等 – 633nm激光管常用染料有 激光管常用染料有 APC APC-Cy
长通滤片
短通滤片
带通滤片
信号检测与分析
当细胞携带荧光素标记物,通过激光照射 当细胞携带荧光素标记物, 产生代表细胞内不同物质, 时,产生代表细胞内不同物质,不同波长 的荧光信号,这些信号以细胞为中心, 的荧光信号,这些信号以细胞为中心,向 空间360度立体角发射,产生散射光和荧光 度立体角发射, 散射光和 空间 度立体角发射 产生散射光 信号. 信号. 以激发光光源波长 以激发光光源波长488nm为例示意图: 为例示意图: 为例示意图
FCM的科研应用
树突细胞研究 干细胞研究 癌症病人的多药耐药性 细胞动力学功能研究 环境微生物分析 流式细胞术与分子生物学研究
FCM的应用——肿瘤学
细胞周期分析 细胞凋亡的分析
凋亡细胞的分析 凋亡相关蛋白的分析
肿瘤相关基因表达的研究 多药耐药基因的研究
细胞周期分析
G2 M
G1 细胞周期 G0