细胞融合技术

细胞融合技术综述

姓名徐帅班级10级生物工程学号14103401469

摘要：细胞融合技术作为细胞工程的核心基础技术之一,已在农业、医药、环保等领域取得了开创性的研究成果,而且应用领域不断扩大。细胞融合技术不

仅为核质关系、基因调控、遗传互补、细胞免疫学、肿瘤发生、基因定位、衰老

控制等理论领域的研究提供了有力的手段,而且被广泛应用于免疫学、遗传学、

发生生物学,特别是在单克隆抗体及动植物远缘杂交育种等方面具有十分重要的

意义。随着细胞融合技术研究的不断深入,细胞融合技术的发展前景及其产生的

影响将日益显著。文章综述了细胞融合技术中的常用方法：仙台病毒、诱导法、聚乙二醇/ 化学诱导法、电融合诱导法、激光诱导法及此技术的最新研究进展：基于微流控芯片的细胞融合技术、高通量细胞融合芯片等，并对它们的优缺点进

行讨论。并综述了有利于细胞融合技术完善的基础理论研究：细胞同步性和单方

的染色体丢失现象。同时提出了未来研究方向的设想。

前言：细胞融合技术是20世纪60年代迅速发展起来的一项新兴细胞工程技术[1]。细胞融合(cell fusion)也称细胞杂交( cellhybridization) 、原生质体融合

(protoplast fusion)或体细胞杂交(somatic hybridization), 是指细胞通过介导和培养, 在离体条件下用人工方法将不同种的细胞通过无性方式融合( 合并) 成一个核

或多核的杂合细胞的过程[1]。细胞融合不仅为细胞的起源、核质关系、肌肉

骨骼胎盘的发育[2] 、肿瘤发生、干细胞介导的组织再生等理论领域的研究提供

了有力的手段[3] ,而且被广泛应用于微生物学、育种学、发生生物学,特别是在单

克隆抗体[4 - 5] 及动植物远缘杂交育种方面具有重要意义。

一 . 细胞融合技术发展的回顾

人们很早就注意到了在自然条件下发生的细胞融合现象,首先在病料组织中发现了由细胞融合产生的多核细胞,紧接着发现在脊椎动物和无脊椎动物的正常细胞中也可发生细胞融合。随后在体外组织培养中也发现了离体细胞的融合现象。自从发现活病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现了灭活病毒促进动物异种细胞的融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动细胞融合技术跃上新的台阶。原生质体的大量制备技术限制了植物细胞融合技术的发展,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功后,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。然而,由于病毒诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们又找到了比病毒简便、快速和高效且比病毒更易制备和控制、活性稳定、使用方便的化学物质PEG,作为病毒的替代物诱导细胞融合,这是一个里程碑式的发现,引起实验生物学的“无声革命”。但在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内(50%-55%)对细胞毒性很大,因此人们又找到了新的方法来替代PEG介导细胞融合法,这些新方法有电脉冲诱导细胞融合技术和激光融合技术等。总之,细胞融合技术在实践中不断发展和完善,细胞融合方法得到了不断的更新和改进,融合率也得到逐步的提高。现在新的细胞融合方法正在尝试将各种物理、化学手段综合应用,使细胞融合的方法和手段操作更为简便,便于量化研究,同时又能使融合率得到不断提高的方向发展。

1.动物细胞融合

一些致癌病毒虽然能够诱导细胞融合,但由于具有毒性大等潜在的危险性而在应用上受到很大的限制,由此科研人员又试图尝试使用灭活的病毒来

作为促融物,并且以异种细胞作为融合对象。1965年,英国Harris等报告灭活病毒可以

用来融合不同种动物的细胞,并且指出由此产生的杂交细胞可以

存活。当时世界上许多报刊很快就对这一发现在生物学上的重要性做出了评价,认为这是在细胞融合研究中的又一次突破。他们的贡献在于证明了灭活

的病毒可以作为一般方法用来在一定的条件下融合动物细胞,而且差异很大的动物种之间的细胞可以被诱导融合,融合的细胞可以存活。1967年Weise和Green发现在人和鼠的融合细胞中,人的染色体优先丢失,并证明利用这一特点有可能对人染色体上的基因进行定位。1970年Ladda又进一步发展了去核的小鼠成纤维细胞进行融合实验,开始了各种细胞重组的研究工作。从发现病毒能够诱导细胞融合之后,动物细胞融合的研究工作迅速发展起来。然而,由于HVJ诱导细胞融合存在着病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异大等原因,人们一直试图发现一种替代物作介质诱导细胞融合。

2.植物细胞融合

植物细胞融合技术的发展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸钠处理原生质体使之凝集、融合。但那时还不能用酶法大量制备原生质体,使实验受到原生质体数量的限制,因此植物细胞融合的起步比动物细胞融合要迟十年左右。直到1960年Cocking 用酶法大量制备有活力的原生质体获得成功,才使植物原生质体的融合工作迅速发展起来。1972年美国科学家Carlson等将粉蓝烟草和郎氏烟草两个异种的体细胞融合成功。20世纪70年代,细胞融合的研究范围又扩展到植物间、动物间、动植物间、甚至人体细胞与动植物细胞之间。

二.细胞融合的常用方法

1.生物法自从发现活的仙台病毒可在体内介导癌细胞融合后,人们又实现

了利用灭活的病毒促进动物异种细胞融合,从而打破了细胞融合的种属屏障,推动

细胞融合技术跃上新台阶。解决病毒制备困难、操作复杂、灭活病毒的效价差异

等问题是病毒诱导细胞融合新的研究方向。

2. 化学法

2.1盐类融合法

此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。今后研究应提高其融合率 ,使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。

2.2高钙和高 pH值融合法

Keller首先发现高 Ca2 +和高 pH值可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内 2个光敏感突变体诱导融合成功并获得 100余株体细胞杂种。提高该方法的使用范围是亟待解决的问题。

2.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)

加拿大籍华人高国楠 (1974)用聚乙二醇 ( PEG)为融合剂诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈加野豌豆与豌豆的融合。此法比病毒更易制备和控制 ,活性稳定 ,用 PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合。在PEG诱导细胞融合的有效浓度范围内 ( 50%～55%)对细胞的毒性应进一步减小。聚乙二醇(PEG)是一种多聚化合物,不同种类微生物对PEG分子质量的要求不尽相同。放线菌适用分子质量常为1 ku～1.5 ku,也有人使用0.4 ku～6 ku,真菌一般采用4 ku～6 ku,细菌用1.5 ku～6 ku。亲本原生质体制备好后,即可进行融合。关于促融机制,一般认为PEG本身是一种特殊的脱水剂,它以分子桥形式在相邻原生质体膜间起中介作用,进而改变质膜的流动性能,降低原生质膜表面势能,使膜中的相嵌蛋白质颗粒凝聚,形成一层易于融合的无蛋白质颗粒的磷脂双分子层区。在Ca2+存在下,引起细胞膜表面的电子分布的改变,从而使接触处的质膜形成局部融合,出现凹陷,构成原生质桥,成为细胞间通道并逐渐扩大,直到两个原生质体全部融合。