微生物与环境监测

三、其他指示微生物
致病菌的指示菌： 1.沙门氏菌（Salmonella）
种类繁多，有些对人和动物均有致病力，如肠炎沙 门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等， 能引起人类伤寒症、急性胃肠炎和败血症等， 经粪—口传播，污染食品、药用动物脏器等， 在口服用药和食品中不得检出。

常用的方法也有多管发酵法和滤膜法。 多管发酵法是自总大肠菌群乳糖发酵试验的阳性 管中取1滴转种于EC培养基，44.5℃培养。然后 观察结果。 用滤膜法检测时采用的培养基有区别，总大肠菌 群滤膜法采用的固体培养基为品红亚硫酸盐（钠） 培养基，粪大肠菌群则采用FMC培养基。


水中粪大肠菌群与肠道病原微生物具有相关 性，是粪大肠菌群作为指示菌的重要依据；
≤4 000
≤40
≤7 000 ≤4 000
≤75 ≤40
2.霉菌和酵母菌总数

霉菌和酵母菌数（fungi and yeast count）是指环境中被测样品经过处理， 在一定条件下培养后，所得1g或lm1检样 中所含的霉菌和酵母菌菌落数。

霉菌和酵母菌是异养型微生物，能致病 或产毒素。
检测方法 用倾注培养平板法。多采用孟加拉红 （虎红）培养基、高渗察氏培养基或加 有抗菌素的马铃薯—葡萄糖培养基。 环境样本作一定倍数稀释后，定量注入 灭菌平皿。 倾入培养基混匀，凝固后置入25～28 ℃ 温箱培养3～5天观察平板上菌落生长情 况并计数。
大肠杆菌较理想 ，109个／ml；但鉴定 方法比较复杂 ； 含有大肠杆菌在内的总大肠菌群与粪大 肠菌群。

1.总大肠菌群
总大肠菌群（total co1iform），也称大 肠菌群（coliform group或co1iform）； 它们是一群能在37 ℃，24 h内发酵乳糖 产酸产气，需氧或兼性厌氧的革兰氏阴 性无芽孢杆菌。 形成特殊的菌落特征； 大肠菌群不是分类学上的一个名称，而 是人为定义的名词。
结果： 以每毫升或每克检样中菌落形成单位 （cfu／m1或g）来表示。
二、粪便污染指示菌
病原菌一般在环境中存在的数量不大， 而且检测方法较复杂，难以直接测定。 其他微生物作为代表，间接指示肠道病 原菌存在。 粪便污染指示菌。

理想条件： （1）是人畜粪便中的正常菌，且数量比粪便 中其他菌为多； （2）受人畜粪便污染的环境中可检出，而未 受污染环境无该菌存在； （3）排出至环境后，该菌存活时间与肠道致 病菌相当或略长； （4）对氯等消毒剂及其他不良因素的抵抗力 略强于肠道致病菌； （5）检出与鉴定方法比较简便迅速。
每100 ml水样 粪大肠菌群 数 1～200 水门氏菌检出情况
水体种类 淡 水
检样件数
29
阳性检出 数目 8 百分率/% 27.6
201～2 000 ＞2 000
海 水 1～70 71～200 201～2 000 ＞2 000
27 54
184 74 91 75
19 53
12 21 40 45
85.2 98.1
食* 肉灌肠类 糕点、面包冷加工 品 糕点、面包冷加工 化*5 妆 品 药*6 眼部、口唇、口腔黏 膜 儿童化妆品 其他化妆品 中药片剂 丸 剂 散剂
特级 一级 二级 出厂 销售 出厂 销售 出厂 销售
≤100 ≤150 ≤50 ≤500 ≤100 ≤100 ≤100 ≤500 ≤500 ≤500
品
大肠菌群值

水： 大肠菌群值＝1 000 m1／大肠菌群数 土壤 大肠菌群值＝l g／大肠菌群数
样品 I 地表水*1 II III Ⅳ Ⅴ 游泳池水*2 饮用水 医院排放污水*3
总大肠菌群
粪大肠菌群 ≤200个/L ≤2 000个/L ≤10 000个/L ≤20 000个/L ≤40 000个/L
（1）测定方法
1．多管发酵法（multiple-tube fermentation），又称最
大可能数法（most probable number，MPN） 主要步骤： ①初发酵试验： 加入含有乳糖蛋白陈培养基（液）中，经37 ℃培养 24 h， 观察产酸产气情况以初步判别是否有大肠菌群存在。
观察结果：

复发酵试验中仍有产酸产气者即最后确证为有 大肠菌群存在。 根据初发酵管的数目及试验所用的检样量，利 用数理统计原理或查阅专用统计表，最后算出 每毫升检样中大肠菌群的最可能数目。

2.滤膜法（membrane filtration technique，MFT）



水样 滤膜 抽滤细菌 滤膜培养， 鉴定并计数典型菌落， 计算总大肠菌群数。
微生物与环境监测
Microbiology Department. College of Resource & Environment SWU. Li Yong
一、指示微生物
指示微生物（indicator microorganism） 或称指示菌（indicator bacteria） 是在常规环境监测中，用以指示环境样品 污染性质与程度，并评价环境卫生状况的 具有代表性的微生物。
6.5 28.4 44.0 60
3.粪链球菌
粪链球菌（Streptococcus faecalis）是短链 状的革兰氏阳性球菌。 在人粪便内数量很多，每克成人粪便中约含有 2×108个，仅次于大肠菌群细菌。 其为粪便污染指示菌的优点是在水中不会自行 繁殖，但抵抗力弱于病菌。 粪链球菌可为水质细菌学评价提供有意义的补 充材料。


主要生物性污染：细菌、真菌、病毒等各 类微生物均有。
1.细菌总数
细菌总数（total bacteria count）： 指环境中被测样品，在一定条件下（培 养基成分、培养温度和时间、pH、通气 状况等）培养后所得的1m1或lg检样中所 含的细菌菌落总数。 它反映环境中异养型细菌的污染度，也 间接反映一般营养性有机物的污染程度。
4.产气英膜梭菌
产气英膜梭菌（Clostridium perfringenes）为 革兰氏阳性具有芽孢、能还原亚硫酸盐的厌氧 杆菌。 存在于人粪（成人每克粪内有此菌105～106个） 及温血动物的粪便内，可作为粪便污染指示菌。

优点： 有芽孢，对氯等消毒剂及外界不良环境 具有较强的抵抗力， 能在水中较长期存在， 特别适用于在含有有毒物质（如氯等） 的水体中检测是否有过粪便污染。

1．液态与固态对象中的细菌总数 天然水体、饮水、饮料等液体物 土壤、污泥、堆肥、食品、化妆品、药 品等固态物， 常用倾注平板培养法或平板表面涂布培 养法。
国家卫生标准中规定： 营养肉汤琼脂培养基， 将经过一定倍数稀释的样品悬液，定量 接种于琼脂培养基平板，或倾注混匀， 或表面均匀涂布； 在有氧条件下，37℃培养48h观察平板上 菌落生长结果。
②平板分离。 将初发酵试验产酸产气的发酵管分别接种在伊红 美蓝琼脂平板上，置37℃培养24h，观察菌落形 态。 挑选可疑为大肠菌群细菌的菌落涂片、革兰氏染 色、镜检和进行证实试验。 ③复发酵试验（证实试验）。 上述可能为大肠菌群的菌落再次接人乳糖蛋白陈 培养液，置37℃温箱培养24h后观察结果。
主要步骤： ①水样过滤
②培养 观察结果： 通过菌落特征及镜检菌体形态初步确定大肠菌群 细菌； 凡革兰氏阴性无芽孢杆菌再接入含乳糖蛋白陈培 养基中以确证为大肠菌群细菌； 最后根据通过水量及滤膜上长出的肯定为大肠菌 的菌落数换算出每升水中大肠菌群数。
结果表达方式 ： 大肠菌群数

又称大肠菌指数，其表示方法有多种，地表水环境 质量标准、生活饮用水卫生标准、游泳池水卫生标 准中以个／L表示之；食品卫生标准中用个／m1表示。 是指水样可检出1个大肠菌群细菌的最小水样容积， 此值愈大即表示水中大肠菌群数愈少。
2．空气中的细菌总数 平板暴露沉降法 仪器法

平板暴露沉降法： 采用直径9cm平皿，将营养琼脂平板在 1.2 m高处暴露5 min，37℃培养48h，计 数生长菌落数。 测定的结果不是十分准确。 经济方便，有实用价值。

仪器法中以固体撞击式采样器多用。
结果： 采用个／m1为单位来表示 cfu（colony forming unit）表示 ：指 单位体积、单位表面积或单位质量检样 中的菌落形成单位。
2.粪大肠菌群
粪大肠菌群（fecal co1iform）是能在44.5℃（44～ 45℃）发酵乳糖的大肠菌群，亦称耐热性大肠菌群 （thermoto1erant coliform）。 包括4个属，埃希氏菌属为主，其他3个属数量较少。 多数大肠杆菌的菌种可以在44～45℃条件下生长。

粪大肠菌群数与粪便中大肠杆菌数直接相关，在 人粪中粪大肠菌群细菌占总大肠菌群数的96.4％； 在外环境中粪大肠菌群不易繁殖， 粪大肠菌群较总大肠菌群作为粪便污染指示菌意 义更大。
方法评价
（1）发酵法：（MPN法）步骤多，耗时长，得到结 果需要72h，不能及时指导实践工作。 （2）滤膜法（MFT法）：操作简单，可现场过滤水 样，避免运送水样的麻烦，且缩短时间。但此法不 适用于混浊度高的水样。 （3）总大肠菌群中细菌并非全部来自粪便，可能由 腐败的植物、土壤等其他环境带来，放可能导致某 些不准确性。 （4）饮水加氯消毒可杀灭大肠菌群而难杀灭肠道病 毒，故大肠菌群不能指示水中病毒。
细菌总数的卫生标准
对象 水 体 样品 饮用水*1 矿泉水*2 游泳池水*3 消毒牛乳 全脂奶粉 水源水 灌装水 细菌总数/（cfu/ml或g） 霉菌数/（cfu/ml或g） 100 ＜5 ＜50 ≤1 000 ≤30 000 ≤20 000 ≤30 000 ≤50 000 ≤20 000 ≤50 000 ≤5 000 ≤10 000 ≤1 000 ≤1 500 ≤500 ≤500 ≤1 000 ≤10 000 ≤50 000 ≤100 000
5.蛭弧菌
蛭弧菌（Bdellovibrio）是一类以捕食细菌为生的 寄生菌，依靠对宿主菌的寄生和裂解使自身得到 生长繁殖。 当水体受到粪便污染时，可供蛭弧菌寄生的宿主 增加，蛭弧菌因而大量繁殖，数量增加，从而对 污染起到指示作用。

生长繁殖需要一定的时间，故其对污染的指示有一 个滞后期。 当蛭弧菌数量升高后，可长时间持续较高的水平。 可用蛭弧菌联合大肠菌群表示水体所受粪便污染的 新旧或区别污染是否连续。
≤18个/L 0个/100 ml 0个/100 ml 一级≤500个/L 二级≤1 000个/L
三级≤5 000个/L
瓶装汽水
≤6个/ml ≤40个/ml 不得检出/ml
含乳饮料
天然矿泉水 蜂蜜 白糖 熟肉制品
≤30个/ml
≤30个/ml ≤30个/ml
消毒牛乳
酸牛乳 全脂乳粉
≤90个/ml
≤90个/ml ≤40个/ml

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由于人粪便中粪大肠菌群数多于粪链球菌，动物 粪便中则相反，因此，在水质检测时可根据两菌 菌数比值不同而推测粪便污染的来源。 粪大肠菌群／粪链球菌的比值（Fe／Fs）大于或 等于4，则认为污染主要来自人粪； 如小于或等于0.7，则认为污染主要来自温血动物 的粪便； 如比值小于4而大于2，则为混合污染但以人粪为 主； 如比值小于1而大于0.7，则为混合污染但以动物 粪便为主。
我国公共场所空气细菌总数标准*
沉降法/（个/皿） 适用范围 撞击法/（cfu/m3） ≤1 000 ≤1 500 ≤2 500 ≤10 ≤10 ≤300 3～5星级以下宾馆，饭店 2星级以下宾馆和非星级带空调宾馆，饭店 普通饭店，招待所，酒吧，茶座，咖啡厅， 图书馆，博物馆，美术馆，飞机客舱 影剧院，音乐厅，录像厅，医院候诊室，候 机室旅客列车车厢，轮船客舱，饭馆（餐厅） 展览馆，商场（店），候车室，候船室 游泳馆

肠杆菌科细菌主要包括4个菌属：
埃希氏菌属（Escherichia）在此菌属中与人类 生活密切相关的仅有一个种，即大肠埃希菌也 称大肠杆菌； 其次有柠檬酸杆菌属或称枸橼酸杆菌属 （Citrobacter）、 克雷伯菌属（Klebsiella）、 肠杆菌属（Enterobacter）。