RNA干扰

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(1) siRNA的设计
理想的siRNA序列是特异性强，抑制效率高。 可通过检索相关基因的文献报道序列，或者通过在线设
计软件进行，一些技术力量较强的化学合成公司可提供 免费设计。 如果有可能，多设计几条siRNA 序列，以筛选最特异、 最有效的siRNA序列。
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第二部分
哺乳动物系统的RNAi实验设计
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主要容
1. 需要短期抑制还是长效抑制? 2. 采用siRNA进行实验的途径 3. 构建shRNA表达载体进行实验 4. siRNA设计需要注意的问题 5. 脱靶效应 6. 转染是RNAi实验的瓶颈
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(1) RNAi Off-target(脱靶效应)是什么？
RNAi Off-target(脱靶效应)：简单地说，就是siRNA转染
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主要内容
1.RNAi的概念 2.RNAi的启动途径 3.非哺乳动物系统的RNAi实验 4.哺乳动物系统的RNAi实验 5.RNAi效应表现
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影响发现，某脂质体L2K可以引发1908个基因的表达变 化，既包括下调，也包括上调。如果恰好转染试剂本身 会导致某基因表达上调，可能出现转染siRNA后该基因 可能会出现表达不变甚至增强的现象，从而出现假阴性 现象，如果恰好转染试剂本身会导致某基因表达下调， 则会出现假阳性现象。
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(3) 阳性对照siRNA的重要性
阳性对照siRNA采用确认有效的siRNA，针对某些较容
易检测基因，如甘油醛－3-磷酸脱氢酶（GAPDH）基因； 用于确认RNAi实验过程的有效性，包括转染条件、检 测方法是否可行等； 阳性对照siRNA在RNAi实验初期或在新的转染体系进行 RNAi实验时很重要，容易被忽视，缺乏阳性对照siRNA， 实验出问题无法找原因，耽误时间。
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1.RNAi的概念
RNA干扰(RNA interference)是双链RNA（dsRNA)特异
性地结合到与之序列互补的mRNA上，导致mRNA降解， 从而介导的转录水平基因表达抑制。
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3.非哺乳动物系统的RNAi实验
如线虫、果蝇等可通过与靶基因序列互补的长链dsRNA
（通常>200bp）介导RNAi的发生 。 长链dsRNA通常可以通过体外转录获得。
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(2) 阴性对照siRNA的作用
阴性对照siRNA通常在进入细胞后不会引起任何基因表
达的改变，从而反映出小分子RNA片段进入细胞后对基 因表达的非特异影响。
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2.RNAi的启动途径
(1) dsRNA途径 (2) siRNA途径 (3) shRNA表达载体途径
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(2) siRNA途径
小干扰RNA，长21-23bp，双链。 作用机制：双链的siRNA解链并装配入RNA介导的静默
复合物(RISC)，siRNA的反义链引导RISC与mRNA分子 互补结合，并降解mRNA，最终导致特定基因表达的抑 制。
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4.哺乳动物系统的RNAi实验
通过转染siRNA：通常在3-7天可以维持较高的基因表达
抑制效应，效应期的长短主要取决于细胞的增殖速度和 siRNA的有效性。大部分RNAi实验可以在此时间段获得 结果，而且可以通过再次转染获得超过1周的基因表达 抑制时间。 通过转染shRNA表达载体，可以获得超过2周的基因表 达抑制时间，在长效RNAi实验时，选择shRNA表达载 体较为合适。
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(3) shRNA表达载体途径
shRNA表达载体在细胞内表达shRNA后，在Dicer作用下
形成siRNA分子，导致RNAi的发生。
中的非特异反应，这不仅包括siRNA序列，还包括转染 试剂本身或其他相关因素对转染细胞的其他相关基因发 生非特异性的表达变化，从而导致假阳性和假阴性。目 前已广泛引起研究者重视。
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5.RNAi Off-target(脱靶效应)
(1) 什么是RNAi Off-target(脱靶效应)? (2) 脱靶效应如何检测？ (3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？ (4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？ (5) 如何避免脱靶效应？
以前认为高浓度会产生脱靶效应，实际上低浓度同样会
产生脱靶效应。
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(4) 转染试剂是否也会造成脱靶效应？
有人采用基因芯片检测对转染试剂造成的细胞基因表达
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4.siRNA设计需要注意的问题
(1) siRNA序列设计 (2) 阴性对照的作用 (3) 阳性对照的重要性 (4) siRNA荧光标记的问题
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5.RNAi效应表现
RNAi效应导致的靶基因下调可在mRNA水平和蛋白水
平表现，也可能会在细胞形态等生理学方面表现。
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第一部分 RNAi实验基本概念
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(1) dsRNA途径
dsRNA:在非哺乳动物系统中，大于30bp的长双链
RNA(dsRNA)进入细胞后，经过胞质内双链特异性核 酸酶Dicer水解成21-23bp的siRNA，进一步导致RNAi 的发生。 但在绝大多数哺乳动物系统中，超过30bp的dsRNA会 引起细胞潜在的抗病毒机制（干扰素效应）。
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2. 采用siRNA进行实验的途径
(1) 化学合成：首选的siRNA制备方法，最快、最方便 (2) 体外转录 (3) Dicer/RNaseⅢ酶解 这三种方法均可做荧光标记，可及时得知转染效率
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1.需要短期抑制还是长效抑制?
1周以内，采用siRNA较好，无需构建载体，节省时间，
还可以采用2次转染的方法，延长RNAi作用的时间到2 周。 2周以上长效RNAi实验，采用shRNA表达载体较好，效 应持续时间长。
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3.构建shRNA表达载体进行实验
需要构建相关质粒 可利用载体上的抗生素等标记筛选，做长效表达 不能做荧光标记，无法直观知道转染效率
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(4) siRNA荧光标记的问题
采用荧光标记的siRNA可以用来确定转染效率和优化转
染条件，这种方法操作快速，实验费用也不高，但由于 荧光标记的siRNA摄入与siRNA导致的抑制效果时常会 出现不相关性，这种情况在某些细胞系和应用某些转染 试剂时，如脂质体时更为严重。因此在应用脂质体转染 试剂优化转染条件时，不推荐使用荧光标记的siRNA。
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RNAi和siRNA转染
Dr.Jim Engreen Biosystem Co.Ltd.
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内 容
第一部分 RNAi实验基本概念 第二部分 RNAi实验具体设计 第三部分 siRNA转染过程相关问题及解答
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(2) 脱靶效应如何检测？
多种方法可以用于预测和检测脱靶效应，最常见的方法
是基因表达谱芯片的方法。
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(3) siRNA浓度是否和脱靶效应相关？