RNA 干扰技术及其应用

用RNase III 消化长片断双链RNA制备siRNA
其他制备 siRNA 的方法的缺陷是需要设计和检验多个 siRNA序列以便找到一个有效的siRNA。 这种方法——制备一份混合有各种siRNAs ‚混合鸡尾 酒‛ 就可以避免这个缺陷。 这个方法是选择通常是 200—1000 碱基的靶 mRNA 模版， 用体外转录的方法制备长片断双链 dsRNA ，然后用 RNase III (or Dicer) 在体外消化，得到一众siRNAs‚混 合鸡尾酒‛。 在除掉没有被消化的dsRNA后，这个siRNA混合物就可 以直接转染细胞，方法和单一的siRNA转染一样。 由于siRNA混合物中有许多不同的siRNAs，通常能够保 证目的基因被有效地抑制。
2001年Elbashir等《 Nature》上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培 养细胞中诱导特异性基因沉默。
2、 RNA干扰的机制
RNAi = RNA interference siRNA = small interfering RNA siRNP = small interfering Ribonucleoprotein RISC = RNA Induced Silencing Complex 越来越多的研究人员开始采用小分子干扰RNA （small interfering RNAs，siRNAs）来抑制特定 的哺乳动物基因表达。 siRNA 即为能够以同源互补序列的 mRNA 为靶 目标并将其降解而介导RNA干扰途径的短片断 双链RNA分子。 如何设计有效的 siRNA 一直是当前 RNAi研究的 热点话题，不同的实验室有不同的结果。
RNAi作用机制
体外实验结果的提示
体外实验表明： RNAi 反应中，加入的 dsRNA 被切割为 21-23核苷酸长的RNA片段，后者会使目的mRNA被切割 为21-23核苷酸长的片段。 从已经发生 RNAi 的果蝇 S2 细胞中， Hammond 等人部分 纯化了一种核酸酶，该核酸酶具有序列特异性，它仅降 解与引起RNAi的dsRNA具有同源序列的mRNA。 那么这种核酸酶是如何确定哪些mRNA该降解而哪些不 该呢？ 由于在纯化该核酸酶时，可以共分离出 21-23 核苷酸长 的dsRNA片段，这暗示该核酸酶对mRNA的切割有可能 是以这些片段作模板指导进行的。根据以上的实验结果， 人们提出一种RNAi作用的简单模型。
RNAi作用的简单模型
当dsRNA导入细胞后，被一种dsRNA特异的核酸内切酶识 别，切割成21-23核苷酸长的小片段，这些片段可与该核酸 酶 的 dsRNA 结 合 结 构 域 结 合 ， 并 且 作 为 模 板 识 别 目 的 mRNA。 识别之后， mRNA 与 dsRNA 的有义链发生链互换，原先 dsRNA中的有义链被mRNA代替，从酶-dsRNA复合物中释 放出来，而mRNA则处于原先的有义链的位臵。 核酸酶在同样位臵对mRNA进行切割，这样又产生了21-23 核苷酸长的dsRNA小片段，与核酸酶形成复合物，继续对 目的mRNA进行切割，从而使目的基因沉默，产生RNAi现 象。 通过遗传分析的方法 ， 目前已从线虫中已分离到 RDE2,RDE-3和Mut-7等RNAi相关的基因。
1990年Rich Jorgensen 在矮牵牛 花中发现转基因沉默。
1998年，Fire发现线虫的RNA干扰现象。
mex-3 RNA
A control: not stained B: wt C: wt + antisense RNA D: wt + ds RNA
1995 年，康奈尔大学的 Su Guo 博士用反义RNA阻断线虫基因表达 的试验中发现，反义RNA（antisense RNA和正义RNA（sense RNA） 都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。 直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达 的试验中，真正起作用的是双链RNA 。这些双链RNA是体外转录正 义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。 2002年，Zernicka-Coetz等用双链RNA注射小鼠受精卵和着床前的胚 胎，结果发现导入的双链RNA可以特异性的抑制C-mos ， E-cadherin 和GFP基因的表达。Judy Lieberman 和 Premlata Shankar首先向公众宣 布了在动物中利用RNAi技术治疗疾病的研究进展。 同样在2002年，科学家研究了酵母和四膜虫两种生物体的RNAi现象， 他们发现RNAi对染色体的形状有着极大的控制作用。RNAi能永久性 关闭或删除一部分DNA，而不只是简单地使DNA暂时沉默。 2004年，Tomoko和他的同事们发现一种小dsRNA能够作用于神经基 因的表达，并且能在转录水平上直接诱导神经干细胞向神经细胞分化。 这种RNA在基因转录水平上直接参与调控，它被命名为smRNA 。
能基因组学研究以及基因治疗等临床用途。
RNA干扰技术(RNA interference)
RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与 DNA 和蛋白质一起构成生
命的框架。但长久以来， RNA 分子一直被认为是小角色。它从 DNA 那儿
获得自己的顺序，然后将遗传信息转化成蛋白质。然而，一系列发现表明— —这些小分子 RNA 事实上操纵着许多细胞功能。它可通过互补序列的结合 反作用于 DNA ，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子 RNA 可以 通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。 RNAi技术利用双链小RNA高效、特异性降解细胞内同源mRNA 从而阻断 靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。近年来研究表明，将与mRNA 对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（dsRNA）导入细胞，可以使 mRNA发生特异性降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默机制 (post-transcriptional gene silencing,PTGS)被称之为RNA干扰（RNAi）
1、 RNA干扰现象的发现
双链RNA（dsRNA）对基因表达的阻断作用被称为RNA干扰（RNA interference， RNAi）。 双链RNA（dsRNA）经酶切后会形成很多小片段，siRNA 和 miRNA 。 siRNA一旦与信使 RNA(mRNA) 中的同源序列互补结合，会导致 mRNA 失去功 能，即不能翻译产生蛋白质，也就是使基因‚沉默‛了。 1990年，为加深矮牵牛花( petunias)的紫色，Jorgensen 等导入了一个强启动子控制 的色素基因。可是结果与预期相反，许多花瓣颜色并未加深，反而呈杂色甚至白色。 这是由于转基因和同源的内源基因的表达都被抑制了，Jorgensen把这个现象命名为共 抑制(cosuppression)
RNAi广泛存在于自然界
随后，RNAi现象被广泛地发现于真菌、拟南芥、 水螅、涡虫、锥虫、斑马鱼等大多数真核生物中。 这种存在揭示了RNAi很可能是出现于生命进化的 早期阶段。 随着研究的不断深入，RNAi的机制正在被逐步阐 明，而同时作为功能基因组研究领域中的有力工 具，RNAi也越来越为人们所重视。
RNA干扰技术及其应用
葛芹玉 学习科学研究中心
RNA干扰技术(RNA interference)
RNAi（RNA interference，RNA干扰）
近年来的研究表明，将与mRNA对应的正义RNA和反义 RNA组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞，可以使mRNA发生特 异性的降解，导致其相应的基因沉默。这种转录后基因沉默 机制(post-transcriptional gene silencing, PTGS)被称为RNA干扰 （RNAi）。 RNAi相关技术是研究转录后调控的有效工具，可用于功
体外转录
相对化学合成法而言成本比较低，是一种性价比高的 筛选siRNAs的好方法。 更重要的是能够更快的得到siRNAs。 值得一提的是体外转录得到的 siRNAs只要较低的浓度 就可以达到化学合成siRNAs较高浓度得到的效果。 不足之处：实验的规模受到限制，虽然一次体外转录 合成能提供足够做数百次转染的 siRNAs ，但是反应规 模和量始终有一定的限制。 最适用于：筛选 siRNAs，特别是需要制备多种 siRNAs， 化学合成的价格成为障碍时。 不适用于：实验需要大量的，一个特定的 siRNA ；长 期研究。
4、RNA干扰的技术流程
siRNA（ Small interfering RNA）的设计与合 成


siRNA的体内、体外转运
RNAi的检测（核酸及蛋白水平）
4.1 siRNA的设计与合成
siRNA的一般结构： 哺乳动物：21-23bp dsRNA
（UU）dTdT dTdT（UU）
其它生物：更长的片段
‚混合鸡尾酒‛ , siRNA混合物中有许多不同的 siRNAs，通常能够保证目的基因被有效地抑制。
化学合成法
尽管化学合成是最贵的方法，但是却是最方便的— —研究人员几乎不需要做什么工作。许多公司都可 以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。 主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特 殊需求的。 由 于 价 格 比 其 他 方 法 高 ， 为 一 个 基 因 合 成 3-4 对 siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其 他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需 要大量siRNA进行研究； 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因 是价格因素。
RNAi研究的一般技术路线
一般设计原则
（1）从mRNA 的AUG起始密码开始，寻找‚AA‛ 二连序列，并记下其 3' 端的 19 个碱基序列，作为潜 在 的 siRNA 靶 位 点 。 有 研 究 结 果 显 示 GC 含 量 在 30%—50% 左右的 siRNA 要比那些 GC 含量偏高的更 为有效。 （ 2 ）将潜在的序列和相应的基因组数据库（人， 或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他 编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST. （ 3 ）选出合适的目标序列进行合成。通常一个基 因需要设计多个靶序列的 siRNA ，以找到最有效的 siRNA序列。
研究发现，双链RNA是RNAi 的触发物，引发与之互补的单 链RNA ( ssRNA, single-stranded RNA)的降解。经过Dicer (一种 具有RNAase III活性的核酸酶)的加工，细胞中较长的双链 RNA(30个核苷酸以上)首先被降解形成21～25个核苷酸的小分 子干扰核糖核酸(siRNA ，short interfering RNA )， 并 有 效 地 定 位 目 标mRNA。 siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要 中间媒介，它具有特殊的结构特征，即5’端磷酸基团和3’端 的羟基，其两条链的3’端各有两个碱基突出于末端。 由 siRNA 中 的反义链参与指导合成被称为RNA 诱导的沉默 复合体（RISC ）的核蛋白体，再由RISC介导切割目的mRNA分 子中与siRNA反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的 功能。
负对照
一个完整的siRNA实验应该有负对照。 作为负对照的 siRNA应该和选中的 siRNA序 列有相同的组成，但是和 mRNA 没有明显 的同源性。 通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同 样要检查结果以保证它和其他基因没有同 源性。Βιβλιοθήκη 3、制备siRNAs的方法
（1）化学合成; （2）体外转录; （3）用RNase III 消化长片断双链RNA制备 siRNA。这种方法——制备一份混合有各种siRNAs
设计流程（选择siRNA靶位点）
从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每 个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点；根据 5‘和3’非翻译区（UTR)及靠近起始密码子（75个碱基之内） 等富含调节蛋白结合位点区域来设计siRNA。 将候选靶位点与相应的基因组数据库比较，去掉哪些与其它编 码序列同源的靶序列。 设计阴性对照：阴性对照siRNA应与siRNA的核苷酸组成相同 但没有与基因组明显同源的序列。一般通过改变siRNA核苷酸 顺序并经同源序列比较确证而得。