第八章 现代生物技术育种

第二节 组织培养


概念 是指在无菌条件下，将离体的植物材料培养于人工 培养基上，并给以适当的培养条件，使之形成完整 植株或生产出具有一定经济价值的生物产品的一种 技术。 内容及范畴 植株培养、茎尖培养、胚培养、胚珠和子房培养、 花药与花粉培养、离体器官培养、胚乳培养、细胞 培养、原生质体培养、离体授粉受精
第八章 现代生物技术育种
主要内容
第一节 生物技术应用于育种的必要性 第二节 组织培养 第三节 植物原生质体培养和细胞融合
第四节 基因工程
第五节 分子标记及其在育种中的应用
第一节 生物技术应用于育种的必要 性
（一）生物技术的概念 以生命科学为基础，利用生物体的特性和 功能，设计、构建、培育具有预期性状的新物 种、新品种、新品系，以及与工程原理相结合， 进行加工生产，为社会提供商品和服务的综合 技术体系。
相关文献：
曹雪，戴忠良，秦文斌，潘跃平. 植物原生质体融合技术的研究 进展.中国农学通报，2016，32(25)：84-90
张金鹏，韩玉珠，张晓旭，张广臣. 蔬菜原生质体培养及融合的
研究现状与展望.北方园艺，2015（04）:192-195 孙宇涵，王欢，李云. 浅谈林木体细胞融合技术. 中国农学通报，
应用情况

目前已获得转化植株的蛋白酶抑制剂基因有：

大豆胰蛋白酶抑制剂基因(SKTI) 豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(CpTI) 慈菇胰蛋白酶抑制剂基因(API)

外源凝集素基因(GNA)等几类；

其中获得转CpTI基因的植物种类最多，有苹果、 油菜、水稻、番茄、向日葵、甘薯、烟草、马铃 薯等10余种。
植物组织培养概况及其在园林 植物育种中的应用



1902 Haberlandt “植物细胞全能性”的提出 1904 Hanning 离体培养萝卜和辣根菜获得成功 1933 李继㣚发现3mm大小的银杏胚可以在离体培 养下正常生长 1934 White建立番茄根尖的无性系，获得突破，发 现了B族维生素和生长素的作用 40-50年代，Skoog等人发现CTK可以控制芽分化 1958 Reinert和Steward分别报道胡萝卜愈伤组织-体 细胞胚-完整植株
2016，32(4)：136-143
（四）融合体的类型


细胞杂种 胞质杂种 对称融合 不对称融合
简单来说，“三父母胚胎”或“三父母婴儿”技术，指的 是从希望生育的母亲卵子中取出含遗传信息的细胞核，随 后将其注入去掉细胞核的捐赠者的卵子内，然后再通过体 外受精的方式让这一改造过的卵子受精。
二、原生质体融合

两种异源（种、属间）原生质体，在诱发剂诱发下相互接触， 从而发生膜融合、胞质融合、核融合并形成杂种细胞，进一步 培育成杂种植物体，称为原生质体融合或细胞杂交。若取材为 体细胞则称体细胞杂交。






（一）原生质体融合的类型 自发融合、诱导融合 （二）诱导原生质体融合的方法及融合剂 盐类融合法、高钙和高pH融合、PEG法、电场融合等 （三）原生质体融合的步骤 参阅文献 （四）融合体的类型 自体融合、异体融合 （五）细胞杂种的选择和鉴定 互补选择法、可见标记法 （六）细胞杂种的再生和鉴定 形态鉴定、核型分析、分子标记鉴定
自 70 年代末以来，基因工程发展迅速。 1980 年，Kemp 和 Hall 将大豆种子的贮藏蛋白基因引入向日 葵中，得到“向日豆”（ sunbean ）。 Wilmut 研究小组继克隆羊多莉之后，将人的 AAT 蛋白基 因导入绵羊体内，使羊奶中含有人的 AAT 蛋白一头这样的 转基因羊，获得 50 万英镑。
用于植物改良的主要外源基因
抗除草剂基因
抗虫基因 抗病基因 抗逆境基因 改良品质基因
抗除草剂基因
① ② ③ 抗草丁膦(glufosinate)转基因冬油菜； 抗草甘膦(glyphosate农达)转基因大豆、玉米、棉花、油菜、 向日葵、甜菜； 抗磺酰脲类转基因大豆、棉花；
④ 抗溴苯腈转基因油菜、小麦、棉花、烟草； ⑤ 抗阿特拉津(Atrazine)转基因大豆、玉米； ⑥ 抗唑啉酮类除草剂转基因玉米、油菜、甜菜、小麦、水稻； ⑦ 脱卤素酶转基因抗除草剂作物； 此外，解溴苯腈毒害的BXn基因和解2,4-D毒害的tfDA基因等也 在抗除草剂作物选育中获得成功的表达。
（三）原生质体的纯化

1、过滤-离心法

44-169μm的筛网去除大的组织碎片和残渣 900-4500r/min，2min，收集沉淀
简单，但沉积造成挤压易导致原生质体破碎

2、漂浮法

采用比原生质体比重大的高渗溶液，离心后去除下层残渣

3、界面法

采用两种比重不同的溶液，使原生质体处于两液相的界面 之中

转基因植物种类逐年增加



二、植物基因工程的一般程序和方法
①目的基因的分离与克隆
②植物表达载体构建 ③植物遗传转化 ④转基因植株的检测和鉴定
①目的基因的分离与克隆



分离与鉴定基因是DNA重组中的关键步骤之一。 一个基因就是编码一条多肽链的一个DNA片段， 包括启动子、终止子及内含子等。 利用DNA重组技术，可从一个含有10万个基因的 大基因组中，准确地分离出特异的单个目的基因。 目的基因的获得的途径：
生物技术应用于作物育种，可以解决传统育种的 一些特殊困难，扩大育种的基因来源，提高鉴定和选 择的可靠性，加快育种进程，加速繁殖，提高育种效
率等，对于解决新世纪人口与食物问题，以及生物能
源问题，具有十分重要意义。
现代生物技术发展简况

50年代：Watson & Click 发现 DNA双螺旋结 构，揭开生物遗传学分子结构和遗传信息之秘。 70年代：DNA重组技术取得成功，细胞融合技 术、生物反应技术 ( 生物反应器 ) 取得突破性发 展，带来了一场深远的生物技术革命。 90年代：基因工程和分子生物技术取得了大批 应用成果 ——转基因植物及动物、基因工程药 物等。
抗虫基因
比利时植物遗传公司的科学家于1987年首次将苏云金 杆菌(Bacillus thunringiensis)毒蛋白基因导入烟草中得 以表达，表现出对一龄烟草夜蛾幼虫的抗性。经过10 多年的发展，已取得较大的进展，并实现了大面积的 商业化应用。
图 苏云金杆菌的芽孢和伴孢晶体
抗虫基因类别：
抗虫基因有两类：
（二）生物技术应用于育种的必要性
人类二十一世纪面临的三大问题： 世界人口不断增加、石化能源的日趋枯竭、环境 污染的加剧 传统育种方法存在局限 生物技术的创造性 • 打破自然生殖隔离，生物可共享一个基因库 • 有目的地进行基因重组，克服不良连锁 • 有效克服环境影响，选择更可靠
（三）生物技术在育种中应用的意义

遗传转化方法越来越多，转化技术日臻成熟

农杆菌介导法、基因枪法、显微注射、PEG法、电击法、 超声波法、真空浸润法、碳硅纤维介导法等
35个科近200种 矮牵牛、金鱼草、石竹、非洲菊、百合、一品红、杨树、 火炬松、刺槐等等 玉米、水稻、大豆、烟草、马铃薯、矮牵牛、香石竹等 作物已有上百个商业化生产 每年超过300亿美元的销售额
(1)选择生长健壮的3cm～6cm 长的新芽作外植体。 (2)用消了毒的利刃将新芽从从 母体切下。
第三节 植物原生质体培养和细胞融合

一 、原生质体培养
原生质体（Protoplast）：指采用机械或酶解法 去掉细胞壁的裸露细胞 。 （一）原生质体的分离 拟 （二）原生质体的分离方法 南 （三）原生质体的纯化 芥 （四）原生质体的培养 原 生 质 体



1962 年，Arber 发现大肠杆菌对外 来侵入的 DNA 有限制作用，这是 由于菌体内有一种酶，对外来的 DNA 起切割、分解的作用，从而 预言DNA限制性内切酶的存在。 1966 年Weiss 和 Richardson 发现 了DNA 连接酶。


1968 年，Smith 分离出第一个内切 酶。
经过40年的发展，园林植物育种中发展出：



利用茎尖等培养技术进行快繁和工厂化育苗 利用茎尖微芽培养获得无病毒植株 结合细胞和组织培养进行突变体的诱导和筛选 利用花药与花粉培养进行单倍体育种 利用胚乳培养获得三倍体植株 利用胚胎培养和体细胞杂交等克服远缘杂交障碍 利用离体培养进行种质资源的长期培养和远距离运 输 通过组织培养提供生物技术育种的中间材料



从基因水平上修饰遗传物质，定向改造遗 传性状，提高了育种的目的性和精确性 打破物种间的生殖隔离障碍，实现自然界 基因资源的共享，拓展了育种的范围 在很大程度上缩短了育种周期，尤其是木 本植物
植物基因工程在植物遗传改良中的应用进展

用于基因转化的材料增加

原生质体、悬浮培养细胞、愈伤组织、茎段、胚轴、茎 尖、叶片、未成熟胚、种子、花序等
（四）原生质体的培养

固体培养法（平板培养法）

Nagata 和 Takebe 采用1mm薄层固体培养基培养烟草 有利于定点观察单个原生质体的胞壁再生 Kameya 1972年 用3-4ml培养液培养胡萝卜原生质体

浅层液体培养法


双层培养法

Maletzki（1973 ）甘蔗和李文安（1979）黄花烟草培养 成功

从基因文库中筛选 利用分子标记进行基因定位克隆 应用PCR技术扩增分离特定的 DNA 利用转位因子，分离目的基因
a、图位克隆技术 染色体步移（chromosome walking)技术 染色体登陆（chromosome landing)技术 b、转座子或T-DNA标签法 c、PCR扩增克隆 d、以mRNA为基础的基因克隆 e、功能克隆

概况

1972 P.Berg 完成λ-噬菌体与 SV-40 病毒 DNA 的体外拼接，第一 例重组DNA分子

1973 H.Boyer&S.N.Cohen将外源DNA插入pSC101，并进一步引
入大肠杆菌，开创了基因工程的研究

1985 Horsch 等首创叶盘法转化，并获得转基因植株
植物基因工程的优势
郭三堆实验室新研制的 sGKZ8杂交抗虫棉 中国“抗虫棉”之父

一类是 Bt 杀虫蛋白基因 ， 来自苏云金芽孢杆菌，
杀虫毒性为伴孢晶体蛋白，对鳞翅目、双翅目和鞘翅 目昆虫有毒，现已导入棉花、玉米、水稻、烟草、番 茄、马铃薯、胡桃、杨树、落叶松等；

另一类是蛋白酶抑制剂基因，可抑制蛋白酶活性，
干扰害虫消化作用而导致其死亡，是植物对虫害的自 卫反应，主要有丝氨酸类、半胱氨酸类、含金属类、 天冬酰氨类，现已导入棉花、烟草、番茄、龙葵等。
（二）原生质体的分离方法

机械分离法

高渗糖溶液预处理，原生质体收缩，机械破碎 Klercker 1982 分离藻类原生质体 可避免酶制剂对原生质体的破坏，但完整率不 高且仅对高度液泡化细胞适用

酶解分离法

Cocking 1960 常用：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、胼胝 质酶、EA3-867（上海植物生化所复合酶）
1971 年， Nathans 应用Smith 的内 切酶切割 SV-40 病毒的 DNA ，获 得了第一个 DNA 的内切图谱（通 称“物理图谱” physical map）。

1978 年的诺贝尔医学奖
1972 年，伯格（ Berg ）等人用这两种酶成功地进行了λ-噬 菌体与 SV-40 病毒 DNA 的体外拼接。 1977 年，基因工程正式宣布成功——吉尔伯特（ Gilbert ） 分别将编码胰岛素和干扰素（这是两种有用的药物）的 DNA 经过体外重新拼接后，导入大肠杆菌中，分别使大肠杆菌合成 了胰岛素和干扰素。 1978 年的诺贝尔化学奖（其中吉尔伯特的获奖主要是因为 DNA 测序方法的研究）。同时获奖的还有桑格 Sanger（2度获 奖） ，他完成了φ X 噬菌体 DNA 的全测序。
第三节 基因工程

一、基因工程的概念以及研究概况 二、植物基因工程的一般程序和方法 三、基因工程在园林植物ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ种中的作用
一、基因工程的概念以及研究概况

概念 基因工程：在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其他载体分子，构 成遗传物质的新组合，并使之渗入到原先没有这类分子的寄主细胞
内，且能持续稳定的繁殖。