粗蛋白的提取

粗蛋白的提取

一、实验目的

蛋白质是评价蛋内营养价值的重要指标，因此蛋白质含量测定也就成为蛋品质检测中具有重要意义的常规项目。

蛋白质种类繁多，结构复杂，精确的测定难度较大。但各种蛋白质都有其共同的特点——含有一定比例的氮，用测定总氮量的方法，根据蛋中氮与蛋白质的比例关系，推导出蛋白质的含量。

粗蛋白质——蛋内含氮化合物的总称，包括纯蛋白质和氨化物。

二、实验原理

1.消化:样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出。而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。

2CH3CHNH2COOH+13H2SO4——(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O

2. 蒸馏:加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。

(NH4)2SO4+2NaOH——2NH3 +2H2O +Na2SO4

NH3 +4H3BO4 ——NH4HB4O7 +5H2O

3.滴定:硼酸吸收氨后，用酸滴定，测出氮含量，将结果乘以换算系数6.25，计算出粗蛋白含量。推算系数6.25的由来：资料中常见在粗蛋白质这一名词后加注（N×6.25。）各种蛋白质的含氮量由1

4.7-19.5%不等，平均为16%，即每100克蛋白质平均含16克氮。而每测出1克氮，意味着存在100/16克蛋白质，即1克氮相当于6.25 克蛋白质。

NH4HB4O7 +HCl + 5H2O——NH4Cl +4H3BO4

三、实验仪器和试剂

1.实验仪器：

分析天平、国产半自动定氮仪（自动回流消化仪、蒸馏吸收装置）2.实验试剂：

硫酸钾（AR）、五水硫酸铜（AR）、浓硫酸（AR）、40%NaoH溶液（400g/L）、蒸馏水

0.1N盐酸标准溶液（量取9mL盐酸加适量水稀释至1000mL）

4%硼酸（取40g硼酸加水适量溶解后，定容至1000mL容量瓶中）甲基红0.1g、溴甲酚绿0.1g、混合定容至100ml 95%乙醇中，在滴定中加2~3滴于硼酸中。

四、操作步骤

1.取一鸡蛋，将蛋白、蛋黄2部分分离，再分别称重，而后将称重的蛋黄、蛋清分别放在电热鼓风恒温干燥箱50℃～53℃烘干至粉末状，后准确称取样品0.5-1克(过40目筛）。

2. 打开半自动定氮仪。开机后，应先预热仪器，并用蒸馏水蒸馏数分钟，用蒸汽洗涤管路。

3..做空白测定，待空白值合理并且稳定后，方可开始测定样品。

空白测定：以0.5克蔗糖代替试样，耗0.02mol/L 盐酸不应超0.3 ml。

4.量取25ml 硼酸，加2滴甲基红－溴甲酚绿混合指示剂

5.将接收液三角瓶套上，馏出管口应在液面之下。向消化管内加入

10～20ml蒸馏水。

6.套上消化管，向消化管内加碱。直至消化管内的液体呈黑色(呈强碱性)，按下蒸馏开关，向消化管内通入蒸汽。

7.蒸馏出来的氨气被硼酸吸收，硼酸即变蓝绿色。

8.至三角瓶内的液体总量达100-120 ml后，令馏出管口离开液面，继续蒸馏1min.并用少许蒸馏水冲洗管口外壁。

9.移走吸收液三角瓶，准备滴定,蒸馏结束。

10.待消化管内的废液自动吸出后，移走消化管。

11.重复以上操作，进行下一测定。（顺序是: 准备硼酸、套上消化管、加碱、通入蒸汽蒸馏）

12.计算：

五、注意事项

1.当样品消化液不易澄清透明时，可将凯氏烧瓶冷却，加入30%过氧化氢2-3ml后再继续加热消化。

2.消化时不要用强火，应保持和缓沸腾，以免黏贴在凯氏烧瓶内壁上的含氮化合物在无硫酸存在的情况下消化不完全而造成氮损失。

3.样品含脂肪或糖较多时，消化时间要长些。同时注意消化过程中产生泡沫溢出瓶外。

4.在蒸馏过程中注意接头处有无松漏现象。

5.蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面清洗管口，再蒸1分钟后关掉热源。否则可能造成吸收液倒吸。