牛结核病抗体检测试剂盒

BOVIGAM TM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒

牛结核病的体外诊断试剂盒，仅限兽医诊断实验室使用

一、简介

牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种疾病，世界各国均有发生，在奶牛业中具有非常重要的地位。在一些国家，某些奶牛群的总体发病率接近60-70％。

二、描述

BOVIGAM TM是一种牛结核病的体外快速诊断试剂盒，其原理基于血液T淋巴细胞对牛结核分枝杆菌PPD的细胞免疫反应。

结核菌素PPD抗原递呈到全血组织培养物中的淋巴细胞后，感染牛结核分枝杆菌的细胞就能产生IFN-γ，并通过基于单克隆抗体的夹心ELISA检测到。未感染牛结核分枝杆菌的淋巴细胞不会产生IFN-γ，因此，γ-干扰素的检测与牛结核分枝杆菌感染相关。

BOVIGAM TM在牛结核菌素皮肤试验后使用。在皮肤试验检测出阴阳性结果后3-30天，可用γ-干扰素试验来确诊。

三、现场研究

用澳大利亚、美国、爱尔兰、新西兰、意大利和西班牙的13 000头牛进行田间试验，结果表明BOVIGAM TM在诊断牛结核病时更敏感，甚至能检出早期感染牛。

在USDA/ARS/国家动物疾病中心的家畜细菌病研究中心(美国爱荷华州Ames)，用20头对灭活牛结核分枝杆菌敏感的Hereford食用牛进行了实验室对照研究。比较了BOVIGAM TM 对美国PPD和辉瑞澳大利亚PPD的反应，表明不管用美国的PPD还是用澳大利亚的PPD刺激，所有牛都表现为阳性。另外，新西兰的研究表明，试剂盒的特异性不受皮肤试验的影响，在尾根皱襞试验（CFT）后3-30天使用时，本试剂盒比颈部皮肤试验（CCT）更加敏感。

四、试剂盒组成

试剂盒储存于2-8℃。除酶标结合物外，所有试剂在使用前恢复至室温(22° ± 5°C)。用完后立即放回2-8℃。

1.酶标板（包被γ-干扰素抗体）2块96孔板 10块96孔板30块96孔板可直接使用

2.牛γ-干扰素阳性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL 冻干，用去离子水或

蒸馏水重新溶解

3.牛γ-干扰素阴性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL 冻干，用去离子水或

蒸馏水重新溶解

4.绿色稀释液（血浆稀释缓冲液，含

0.01%硫柳汞）

1×15mL 1×60mL 1×175mL 可直接使用

5.20×洗液（含0.01%的硫柳汞）1×100mL 3×125mL 2×500mL 用去离子水或蒸馏

水稀释

6.100×酶标结合物（HRP标记的抗牛γ-干扰素抗体，含0.01%的硫柳汞）1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL 冻干，用去离子水或

蒸馏水重新溶解

7a.蓝色稀释液（5倍浓缩的酶标结合物稀释缓冲液，含0.01%的硫柳汞）N/A 1×25mL N/A 用去离子水或蒸馏

水稀释

7b.蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲

液，含0.01%的硫柳汞）

1×30mL N/A 2X175mL 可直接使用

8.底物缓冲液（含H2O2）1×30mL 1×125mL 2×175mL 可直接使用

9.100倍浓缩的显色剂溶液（含溶于

DMSO的TMB）

1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL 用底物缓冲液稀释10.终止液(0.5M H2SO4) 1×15mL 1×75mL 1×175mL 可直接使用

五、试剂盒未提供的材料

A. 采血

1. 肝素锂真空管每头动物1支

2. 18号针头－1寸每头动物1支

3. 针管每位采血人员2-3支

B. 血液培养

1. 无菌的5或10mL移液器 每头动物1根

2. 无菌的24孔组织培养板每8头动物1块

3. 分装用的枪头（5mL）每群动物3支

4. 无菌的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.2) 每头动物100µL

5. Bovigam牛型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支

6. Bovigam禽型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支

C. 收获血浆

1. 100-1000 µL枪头每头动物3支

2. 用于储存血浆的1mL离心管(放在96孔板架上)和盖子每30头动物1个架子

D. 牛γ-干扰素酶免疫试验

1. 12道移液器吸头每头动物3支

2. 各种规格的聚丙烯管、酶免疫试验的试剂反应槽和枪头

实验仪器

1. 37℃培养箱

2. 精密可调移液器（1mL）

3. 1mL、5mL、10mL的移液器

4. 100mL、1L、2L的量筒

5. 6L去离子水或蒸馏水

6. 12道移液器（50µL-300µL）

7. 微量振荡器（可选）

8. 洗板机

9. 酶标仪（必须含450nm和620-650nm的滤光片）

六、试剂配制

1. 抗原

Bovigam试剂盒在美国已被批准用于牛结核病的诊断。本试剂盒使用了特殊制备的禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素刺激抗原，对牛结核病的诊断非常有效。除非其他抗原获得相关权威机构的批准，美国和加拿大的结核病必须用上述抗原进行诊断。USDA批准的确认数据就是用Bovigam禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素刺激抗原进行的。其他抗原在用于官方的诊断目的时必须首先得到确认（在诊断试剂需要强制注册的国家，还必须获得相关权威机构的批准）。

使用前彻底混匀，独立分装（0.3mg/mL），从冰箱拿出后可直接使用。

2. 酶标板

允许酶标板在未开封前恢复至室温，可放置30min以上。

3. 阳性对照和阴性对照

用1mL（2块板和10块板）或2mL（30块板）去离子水或蒸馏水重新溶解相应的对照样品。保证完全溶解！溶解的阴阳性对照在3个月内可储存于2-8℃，但再次使用前必须恢复至室温并充分混匀。

4. 绿色稀释液

恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。

5. 酶标结合物

用0.5mL（2块板）、1.5mL（10块板）或2mL（30块板）的去离子水或蒸馏水重新溶解100倍浓缩的冻干酶标结合物。保证完全溶解！充分混匀，尽量避免起泡！100倍浓缩的酶标结合物必须一直保存于2-8℃，溶解后的酶标结合物必须在3个月内用完。