牛结核病抗体检测试剂盒

BOVIGAM TM牛结核分枝杆菌γ-干扰素检测试剂盒
牛结核病的体外诊断试剂盒，仅限兽医诊断实验室使用
一、简介
牛结核病是由牛结核分枝杆菌感染引起的一种疾病，世界各国均有发生，在奶牛业中具有非常重要的地位。

在一些国家，某些奶牛群的总体发病率接近60-70％。

二、描述
BOVIGAM TM是一种牛结核病的体外快速诊断试剂盒，其原理基于血液T淋巴细胞对牛结核分枝杆菌PPD的细胞免疫反应。

结核菌素PPD抗原递呈到全血组织培养物中的淋巴细胞后，感染牛结核分枝杆菌的细胞就能产生IFN-γ，并通过基于单克隆抗体的夹心ELISA检测到。

未感染牛结核分枝杆菌的淋巴细胞不会产生IFN-γ，因此，γ-干扰素的检测与牛结核分枝杆菌感染相关。

BOVIGAM TM在牛结核菌素皮肤试验后使用。

在皮肤试验检测出阴阳性结果后3-30天，可用γ-干扰素试验来确诊。

三、现场研究
用澳大利亚、美国、爱尔兰、新西兰、意大利和西班牙的13 000头牛进行田间试验，结果表明BOVIGAM TM在诊断牛结核病时更敏感，甚至能检出早期感染牛。

在USDA/ARS/国家动物疾病中心的家畜细菌病研究中心(美国爱荷华州Ames)，用20头对灭活牛结核分枝杆菌敏感的Hereford食用牛进行了实验室对照研究。

比较了BOVIGAM TM 对美国PPD和辉瑞澳大利亚PPD的反应，表明不管用美国的PPD还是用澳大利亚的PPD刺激，所有牛都表现为阳性。

另外，新西兰的研究表明，试剂盒的特异性不受皮肤试验的影响，在尾根皱襞试验（CFT）后3-30天使用时，本试剂盒比颈部皮肤试验（CCT）更加敏感。

四、试剂盒组成
试剂盒储存于2-8℃。

除酶标结合物外，所有试剂在使用前恢复至室温(22° ± 5°C)。

用完后立即放回2-8℃。

1.酶标板（包被γ-干扰素抗体）2块96孔板 10块96孔板30块96孔板可直接使用
2.牛γ-干扰素阳性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL 冻干，用去离子水或
蒸馏水重新溶解
3.牛γ-干扰素阴性对照（含0.01%的硫柳汞）1×1.0mL 2×1.0mL 3×2.0mL 冻干，用去离子水或
蒸馏水重新溶解
4.绿色稀释液（血浆稀释缓冲液，含
0.01%硫柳汞）
1×15mL 1×60mL 1×175mL 可直接使用
5.20×洗液（含0.01%的硫柳汞）1×100mL 3×125mL 2×500mL 用去离子水或蒸馏
水稀释
6.100×酶标结合物（HRP标记的抗牛γ-干扰素抗体，含0.01%的硫柳汞）1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL 冻干，用去离子水或
蒸馏水重新溶解
7a.蓝色稀释液（5倍浓缩的酶标结合物稀释缓冲液，含0.01%的硫柳汞）N/A 1×25mL N/A 用去离子水或蒸馏
水稀释
7b.蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲
液，含0.01%的硫柳汞）
1×30mL N/A 2X175mL 可直接使用
8.底物缓冲液（含H2O2）1×30mL 1×125mL 2×175mL 可直接使用
9.100倍浓缩的显色剂溶液（含溶于
DMSO的TMB）
1×0.5mL 1×1.5mL 2×2.0mL 用底物缓冲液稀释10.终止液(0.5M H2SO4) 1×15mL 1×75mL 1×175mL 可直接使用
五、试剂盒未提供的材料
A. 采血
1. 肝素锂真空管每头动物1支
2. 18号针头－1寸每头动物1支
3. 针管每位采血人员2-3支
B. 血液培养
1. 无菌的5或10mL移液器 每头动物1根
2. 无菌的24孔组织培养板每8头动物1块
3. 分装用的枪头（5mL）每群动物3支
4. 无菌的磷酸盐缓冲液(0.01M pH7.2) 每头动物100µL
5. Bovigam牛型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支
6. Bovigam禽型提纯结核菌素(PPD) 150头动物1支
C. 收获血浆
1. 100-1000 µL枪头每头动物3支
2. 用于储存血浆的1mL离心管(放在96孔板架上)和盖子每30头动物1个架子
D. 牛γ-干扰素酶免疫试验
1. 12道移液器吸头每头动物3支
2. 各种规格的聚丙烯管、酶免疫试验的试剂反应槽和枪头
实验仪器
1. 37℃培养箱
2. 精密可调移液器（1mL）
3. 1mL、5mL、10mL的移液器
4. 100mL、1L、2L的量筒
5. 6L去离子水或蒸馏水
6. 12道移液器（50µL-300µL）
7. 微量振荡器（可选）
8. 洗板机
9. 酶标仪（必须含450nm和620-650nm的滤光片）
六、试剂配制
1. 抗原
Bovigam试剂盒在美国已被批准用于牛结核病的诊断。

本试剂盒使用了特殊制备的禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素刺激抗原，对牛结核病的诊断非常有效。

除非其他抗原获得相关权威机构的批准，美国和加拿大的结核病必须用上述抗原进行诊断。

USDA批准的确认数据就是用Bovigam禽型提纯结核菌素和牛型提纯结核菌素刺激抗原进行的。

其他抗原在用于官方的诊断目的时必须首先得到确认（在诊断试剂需要强制注册的国家，还必须获得相关权威机构的批准）。

使用前彻底混匀，独立分装（0.3mg/mL），从冰箱拿出后可直接使用。

2. 酶标板
允许酶标板在未开封前恢复至室温，可放置30min以上。

3. 阳性对照和阴性对照
用1mL（2块板和10块板）或2mL（30块板）去离子水或蒸馏水重新溶解相应的对照样品。

保证完全溶解！溶解的阴阳性对照在3个月内可储存于2-8℃，但再次使用前必须恢复至室温并充分混匀。

4. 绿色稀释液
恢复至室温并充分混匀，用作血浆稀释缓冲液。

5. 酶标结合物
用0.5mL（2块板）、1.5mL（10块板）或2mL（30块板）的去离子水或蒸馏水重新溶解100倍浓缩的冻干酶标结合物。

保证完全溶解！充分混匀，尽量避免起泡！100倍浓缩的酶标结合物必须一直保存于2-8℃，溶解后的酶标结合物必须在3个月内用完。

注释：酶标结合物起泡过多会变性并降低试验效果。

仅用于10板的BOVIGAM TM试剂盒
将5倍浓缩的蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲液）恢复至室温并充分混匀。

将1份5倍浓缩的蓝色稀释液和4份去离子水或蒸馏水混匀，配制工作浓度的蓝色稀释液（酶标结合物稀释缓冲液）。

工作浓度的蓝色稀释液在3个月内可储存于2-8℃，但再次使用前必须恢复至室温并彻底混匀。

仅用于2板和30板的BOVIGAM TM试剂盒
蓝色稀释液可直接使用。

按下面的试剂配制表，将适当体积的蓝色稀释液和溶解后的酶标结合物混合，制备酶标结合物工作液。

充分而轻柔地混匀，避免起泡。

酶标结合物工作液必须在配制完后的5分钟内使用，未用完的试剂应立即丢弃。

未用完的100倍浓缩的酶标结合物应立即放回至2-8℃。

表2 试剂配制表（用于稀释酶标结合物和显色剂）
酶标板数量浓缩酶标结合物(100×)
或显色剂(100×)的体积稀释液(蓝色稀释液或底物缓冲液)的体积
1 0.12mL 12mL
2 0.24mL 24mL
3 0.36mL 36mL
4 0.48mL 48mL
5 0.60mL 60mL
6 0.72mL 72mL
7 0.84mL 84mL
8 0.96mL 96mL
9 1.08mL 108mL
10 1.20mL 120mL
20 2.0mL 200mL
30 3.0mL 300mL
6. 洗液
配制工作浓度的洗液，将19份去离子水或蒸馏水加入1份20倍浓缩的洗液中，充分混匀。

工作浓度的洗液可在室温贮存2周，未用完的20×浓缩洗液应放回至2-8℃。

注释：20倍浓缩的洗液可能含有结晶盐。

37℃重新溶解结晶。

稀释前充分混匀。

7. 底物溶液
将底物缓冲液和100倍浓缩的显色剂溶液恢复至室温，稀释前充分混匀。

按照试剂配制表，将适当体积的浓缩显色剂溶液和底物溶液混合，使用前配制。

底物溶液必须充分混匀且应当是无色的，如出现蓝色应丢弃。

在配制完后的10min内使用。

注释：如有可能，用灭菌的一次性聚丙烯塑料容器配制底物溶液。

不要使用聚苯乙烯容器或移液管。

盛底物的玻璃器具必须用1N H2SO4或HCl彻底清洗，然后用去离子水或蒸馏水冲洗3遍以上，保证没有酸的残留。

8. 试剂的安全处理
所有废弃或剩余的试剂应根据州和地方的要求进行处理。

七、操作注意事项
1. 除100倍浓缩的结合物外，所有待测血浆和试剂在使用前必须恢复至室温 (22℃+5℃)。

解冻的样品需小心涡旋，充分混和。

加热的温度不要超过37℃。

注释：一整瓶试剂恢复至室温需要几个小时。

用室温水浴箱可缩短平衡时间。

2. 试剂盒内所有成分都储存于2-8℃，使用完后马上放回2-8℃。

工作浓度的洗液在两周
内可放于室温(22℃+5℃)。

3. 100倍浓缩的结合物必须一直放于2-8℃，即使在重新溶解时也是这样。

4. 为保证试验效果，必须使冻干试剂完全溶解。

溶解后的试剂至少需放置15分钟，然后
轻柔颠倒混合4-5次；也可以使用滚动振荡装置混合。

使用前再次混匀。

注释：必须用高质量的去离子水或蒸馏水来溶解或稀释试剂，因为实验用水中常见的污
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染物易使辣根过氧化物酶失去活性。

5. 试验开始后不要中途间断。

6. 每份样品换一个一次性吸头，避免交叉污染。

7. 用12道移液器加样，保证待测血浆同时加入各孔中。

8. 酶标板应放在倒置的试管架或相似装置上进行孵育，使孔间误差降至最低。

9. 从酶标板第1列顶端开始，每份待检血浆在邻近孔（比如A行和B行）中做双份重复。

10. 牛γ-干扰素阳性和阴性对照在第4、5、6列的连续孔（如F行用于阳性对照，E行用于
阴性对照）中做3份重复。

按照上面的建议，每块酶标板可双份重复检测15头动物的45份待测血浆。

八、检测步骤
第一阶段—全血培养
步骤：
1. 采血
采集单次皮内试验阳性牛3-30天内的血液。

将采集的血液（至少5mL）放入肝素抗凝的血液收集管中，轻轻颠倒几次混合血液，使肝素溶解。

在室温（22±5℃，避免温度过高或过低）下运送到实验室并在采血后的30个小时内进行培养。

在任何情况下都不应该将血液贮存在冰箱中。

2. 血液分装
分装前血液样品必须均匀混合。

在即将分装前，可用滚筒-振荡器混匀或轻轻颠倒试管10min。

注释：由于本试验需要活的淋巴细胞，因此需要将细胞损伤降至最低。

将抗凝血加入24孔组织培养板，每头动物加三管1.5mL分装的抗凝血（见表3）。

用一次性自动移液器或吸管在无菌条件下进行操作。

表3 吸取血液或抗原至24孔培养板的推荐操作
1号动物NIL A1 AvPPD A2 BoPPD A3NIL A4 AvPPD A5BoPPD A6 2号动物3号动物NIL B1 AvPPD B2 BoPPD B3NIL B4 AvPPD B5BoPPD B6 4号动物5号动物NIL C1 AvPPD C2 BoPPD C3NIL C4 AvPPD C5BoPPD C6 6号动物7号动物NIL D1 AvPPD D2 BoPPD D3NIL D4 AvPPD D5BoPPD D6 8号动物NIL=阴性对照抗原（PBS）；AvPPD＝禽型提纯结核菌素；BoPPD＝牛型提纯结核菌素
3. 加入刺激抗原
无菌加入100µL P BS(阴性抗原对照)，禽PPD或牛PPD至相应的孔。

最好用连续多档移液器如Eppendorf “Combitip”系统进行操作。

抗原必须与分装的血液充分混匀，最好用一个微量振荡器高速振荡1min。

如果没有合适的仪器，将细胞培养板及其盖紧紧固定在一起，在光滑的表面上顺时针和逆时针各旋转10 次。

小心操作不要引起交叉污染，也不要让血液附在盖上。

避免血液起泡。

只有刺激抗原与血液完全混合，试验才能达到最佳效果。

4. 孵育
将含有血液和抗原的组织培养板在37℃湿温培养箱中孵育16-24小时。

5. 血浆样品的收获
将24孔板在室温（22±5℃）500g离心10min可加速血浆的收集。

孵育后，用可调移液器（100-1000µL）小心吸取约500µL的上层血浆，按表4所示转入贮存管中。

为方便操作，可使用96孔贮存架上放置的1mL微管。

每份血浆样品换一个新的吸头。

注释：吸取血浆时应尽量避免吸入细胞。

污染极少量红细胞的血浆不会影响γ-干扰素酶免疫试验。

1号动物的阴性抗原、禽PPD和牛PPD分别位于A1、A2和A3，其它动物依次类推。

C4、C5、C6、G4、G5和G6是空白孔。

这种贮存模式便于用12道移液器将试验样品直接从贮存架上转到酶标板。

转移完试验样品后，将试剂盒提供的阳性对照和阴性对照加入空白孔中。

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样品应做双份重复检测。

贮存架上A、B、C、D行的血浆应分别转移至酶标板的A 和B行、C和D行、E和F行及G和H行。

一个贮存架上的样品对应两块酶标板。

表4血浆贮存的推荐操作
行 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 1N 1A 1
B 2N 2A 2B 3N 3A 3B 4N 4A 4B
B 5N 5A 5B 6N 6A 6B 7N 7A 7B 8N 8A 8B
C 9N 9A 9B x x x 10N10A10B11N11A 11B
D 12N 12A 12B 13N13A13B14N14A14B15N15A 15B
E 16N 16A 16B 17N17A17B18N18A18B19N19A 19B
F 20N 20A 20B 21N21A21B22N22A22B23N23A 23B
G 24N 24A 24B x x x 25N25A25B26N26A 26B
H 27N 27A 27B 28N28A28B29N29A29B30N30A 30B
6. 血浆的贮存
血浆可在2-8℃贮存7天，在-20℃可贮存几个月。

贮存前，每个贮存管必须用合适的盖子密封。

在样品架上标记日期、操作者的首字母、管内容物、动物编号和牛群细节等相关信息。

注释：检测前，样品必须恢复至室温并充分混匀。

警告：血浆在解冻过程可能凝结成块。

只要不妨碍血浆的吸取，凝块不会影响试验结果。

第二阶段－牛γ-干扰素酶免疫试验
1. 溶解冻干试剂，如有需要，还可按“操作注意事项”平衡其他试剂。

2. 加入50µL绿色稀释液至所需孔。

3. 加入50µL待测样品和对照样品至含有绿色稀释液的相应孔中。

对照样品应最后加入。

在微量振荡器上振荡1min，彻底混匀。

如无微量振荡器，可上下吹吸5次。

4. 用盖封板，室温（22±5℃）孵育60±5min。

5. 倒掉板中的液体，室温洗涤6次。

用洗液充满各孔，但不要引起相邻孔的交叉污染，倒
掉洗液，重复操作5次。

第6次洗涤完毕后，将酶标板放在干净的滤纸上拍打几次，尽量去除残留的洗液。

注释：可使用自动洗板机洗涤，优化洗涤循环数和每个洗涤步骤间的间隔时间，去除背景反应。

确保未结合的物质从孔中充分除去，防止试验失败。

6. 加入100µL新鲜配制的酶标结合物至各孔中。

按试剂配制表（表2），用工作浓度的蓝
色稀释液稀释酶标结合物。

按步骤3充分混匀。

7. 封板，按步骤4孵育60±5min。

8. 按步骤5洗涤。

注释：底物溶液最好在洗涤后配制。

9. 加入100µL新鲜配制的底物溶液至各孔中。

按步骤3充分混合。

10. 封板，按步骤4避光孵育30min。

注释：从加入底物至第一个孔时开始计时。

11. 每孔加入50µL终止液，小心操作，避免显色剂从一个孔转到另一个孔，轻轻摇动混匀。

注释：按照与加入底物相同的顺序，以相同的速度加入终止液。

12. 终止后5min内读出OD450nm，以620-650nm作为参照波长，然后用OD值计算结果。

九、质量控制（试验的有效性）
在判定结果前必须检查对照样品的结果。

确定阴性对照和阳性对照的平均OD值。

可接受的平均OD值范围：
1. 牛γ-干扰素阴性对照<0.130
注释：各阴性对照重复孔差值不能大于0.040。

2. 牛γ-干扰素阴性对照>0.700
注释：阳性对照重复孔OD值的变化幅度不超过其平均OD值的30％。

如果有一条标准不符合，试验是无效的，必须重新进行检测。

十、结果判定
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1. 计算每个样品阴性抗原、禽PPD和牛PPD的平均OD值
2. 计算每头动物所有样品阴性抗原、禽PPD和牛PPD的平均OD值。

阳性＝牛型提纯结核菌素的OD－阴性抗原的OD≥0.1且
牛型提纯结核菌素的OD－禽型提纯结核菌素的OD≥0.1
阴性＝牛型提纯结核菌素的OD－阴性抗原的OD<0.1或
牛型提纯结核菌素的OD－禽型提纯结核菌素的OD<0.1
3. 从皮肤试验后3-30天内的牛上采集的血浆样品OD值比禽型提纯结核菌素和阴性抗原
（PBS）的OD值大0.100，表明存在牛结核分枝杆菌感染。

警告：地塞米松治疗或分娩引起的免疫抑制可降低γ-干扰素对结核杆菌抗原的应答。

1周内注射地塞米松或4周内分娩的动物应重新检测，以排除假阴性结果。

十一、检测的局限性
下列因素可导致假性结果：
1. 操作技术不正确
2. 使用非肝素的抗凝剂
3. 循环的γ-干扰素水平过高
4. 免疫抑制
5. 使用了污染的试剂
6. 推荐的检测步骤引起的其他误差
十二、检测步骤简述
第1天-全血培养
1. 采血
2. 分装肝素抗凝血
3. 加入抗原
4. 孵育过夜
5. 收获血浆
6. 贮存血浆（如有必要）
第2天-牛γ-干扰素酶免疫试验
1. 重新溶解冻干试剂
2. 加入绿色稀释液至所需孔中
3. 加入待测血浆（每头动物同时加入）和对照至各孔
4. 孵育60min
5. 洗板
6. 配制酶标结合物并加入各孔
7. 孵育60min
8. 洗板
9. 配制底物溶液
10. 每孔加入底物
11. 孵育30min
12. 终止反应
13. 读取检测结果
14. 结果有效性及判定。