高内涵筛选仪器简介

1.0E1.+00E5+05
© Cellomics, Inc. 1999-2005
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
10-1
10 0
101
wk.baidu.com10 2
103
104
105
10 6
Log (nM)
8
精细的细胞内部分析
Same label intensity, different distribution
▪ Location, location, location…
One label, several potential distributions… … and heterogeneity
Hoechst 33342
间接荧光标记 1° ERK抗体； 2° Alexa Fluor 488
的2抗
基础目标
Circ
3 (红色)
内吞的 EGF
Texas Red荧光标记 的 EGF;
Ring Spots
• 适用与其他MAPKs • 使用别的受体的抗体即可。
29
NUCLEUS MAPK/ERK EGF
-50
IL1-alpha rows E-H
MeanNuc-CytoIntenDiff(TargetCh)
Row B Row F
Row C Row G
COLUMN
Row D Row H
28
12
使用空间分析模块分析EGF激活ERK的实验
通道
靶标
标记物
分析区域
1 （蓝色）
2 (绿色)
细胞核
磷酸化的ERK
26
NUCLEUS NFkB
自动定量的分析
Avg CytoNuc Difference
▪3T3 cells’ NFkB dose-response to TNF-a
0.001
NFkB Translocation Dose Response
500
400
300
200
EC50 = 0.22 ng/ml 100
高内涵研究细胞的本质
3
细胞组学的最新手段：高内涵技术
对每个细胞进行多通道、多靶点的荧光扫描检 测，由成像技术捕获图像信息后，经专用分析系统 进行多指标在线分析，最终高效率地获取细胞内及 细胞间的综合细胞学信息的检测技术平台。
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什么是高内涵？
高内涵：
全自动 单细胞 多靶点 定量的 精细的 细胞分析系统
▪ Spot Analysis 单点分析 • Target Area and Count 目标大小及计数
▪ Intracellular Translocation 胞间迁移 • Average Intensity Difference 荧光强度差值检测 （细胞质和细胞核间）
▪ Cell Morphology 细胞形态 • Object Area, Perimeter, Length, Width, Shape 目标大小、周长、长、宽、形状等
5
每个细胞逐个动态跟踪分析
6
多靶点
▪ Multiple targets,multiple processes, over time
Nuclear Morphology细胞核形态 Calcium Homeostasis钙平衡 Mitochondrial Transmembrane Potential线粒体膜电位 Membrane Permeability细胞通透性
(-)-Epinephrine bitartrate
S(+)-Isoproterenol (+)-bitartrate
X Albuterol hemisulfate
100
(-)-alpha-Methylnorepinephrine
EC50 (nM)
Mean SD
12.0 2.8 25.9 2.1 43.7 3.8 387 78 660 181 1887 213
unconnected tube
node
18
nuclei © Cellomics, Inc. 1999-2006
Myotube Formation Assay肌小管
No Treatment 100mM Nifedipine
Drug Effect as % of Control
120
100
80
60
40
▪ Cellular Intensity/ Expression 细胞内靶标的强度表达 • Total, Average, & Variation of Intensity in primary object and derived Target regions 靶标激活或表达的整体，平均，偏差水平统计
F-Actin Label
Endothelial cells (HUVECs) on Matrigel™ form tubes 内皮细胞形成小管
Raw Image & Overlays from Automated Analysis
Hoechst
rejected object
connected tube
G1 G2
DNA Content (DAPI Intensity)
% Cells in Different Phases
80
Untreated
70
Nocodazole
60
50
40
30
20
10
0
<G1
G1
S
G2
>G2
Cell Cycle Phase
22
Cell Cycle Profiles
Serial dilution (2-fold) of each compound from right to left.
9
Advantage 技术优势
荧光显微镜
• 灵活, 试剂使用广泛 • 逐个细胞观察 • 空间结构分析和定位
酶标仪读板机
• 高通量定量 • 自动, 使用多孔板 • 简单,便于使用
HCS
流式细胞仪
• 单个细胞分析 • 每个细胞多参数分析 • 结果可视化，配套分析软件
10
技术优势
自动数据处理 多指标分析 悬浮细胞
▪ In cytochalasin treated cells there is a re-distribution of red fluorescence; It is mostly near the edges of the cell and is bright
15
16
微丝和点的检测
17
小管形成Tube Formation
0.01
0.1
1
10
100
TNF alpha Concentration (ng/ml)
0
1000
27
NFКB 的转位
M ea nNuc -C yt oInt enDiff(Ta r ge t C h)
Row A Row E
350
300
250
200
150
100
50
0
TNF-alpha rows A-D
Multiple measures of size, shape, texture and position can be combined to define “activity”
BioApplication Used: Morphology Explorer
19
小管形成Tube Formation
细胞凋亡过程
▪ Individual cell responses tell the real story! ▪ 每个细胞还原真实的生物学现象
7
从定性观察到定量标准
HCS
% Max Response
Symbol
Compound
R(-)-Isoproterenol (+)-bitartrate
(±)-Isoproterenol hydrochloride
1.0E1+.00E4+04
EGF (ring spot total intensity) EGF (ring spot total intennsiity))
1.0E1+.00E3+03
1.0E1+.00E2+02 1.0E1+.00E4+04
EREKR(cKir(ccitroctatol tinalteinntseintys)ity) 31
细胞形态
自动化操作 逐个细胞分析 附着细胞
空间结构
酶标仪 +
+++
荧光显微镜
++++
+ 流式细胞仪 + + +
+
高内涵技术 + + + + + + + +
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Data Analysis 数据分析
▪ Cell Counting and Proliferation 细胞增殖计数 • Average cell count per field per well 每个孔每个视野视野细胞计数
▪ Cell Health & Toxicity 细胞健康和毒性 • Object Number 有效细胞计数 • Area, Perimeter 细胞核大小和周长等
12
Thermo Cellomics高内涵生物学应用
通用型应用 ▪ 靶点激活 ▪ 细胞空间分析 ▪ 细胞形态分析 ▪ 逐点扫描 毒性检测应用 ▪ 细胞健康指标分析 ▪ 彗星检测 ▪ 细胞毒性分析 ▪ 微核检测 ▪ 斑马鱼毒性 神经学应用 ▪ 神经生长分析
The world leader in serving science
解析细胞内部的量化工具 ——高内涵分析平台
余长缨 2010年3月
细胞组学时代的到来——解析细胞内涵
DNA Genes
Messenger RNA
Genomics
Protein Proteomics
2
Whole Cell Cellomics
Number of Cells % of Cells
DNA Content
180
160
140
Untreated
120
Ratio of G1/G2
cells = 4.64
100
Nocodazole
80
Ratio of G1/G2
60
cells = 0.05
40
20
0 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
20
0 Valid object count
Number of nuclei per myotube
Mean myotube Mean myotube Mean myotube
area
length prolate volume
Control Nifedipine - myotube inhibitor
EGF刺激Hela细胞的磷酸化的ERK和EGF的分布
5 minutes
30 minutes
30
© Cellomics, Inc. 1999-2005
分析结果
1.0E1+.00E5+05
0 m0in0ummteinsinuutetess 5 m5i0nummteiinnsuutteess 15 m155inmumteiinnsuutteess 30 minutes
23
钙流检测 (每个细胞的检测)
▪ Time vs. intensity of calcium indicator
▪ Stimulator dilution series
100 1
10
0.1
0.01 0 µM
24
B2 (10-9M)
Well MEANs
C2 (10-8M)
D2 (10-7M)
Actual time points (on graph) ~1.4 sec intervals. So, shown here: ~every 5th frame, for ½ the total trace
肿瘤学应用 ▪ 小管形成 ▪ 细胞周期 ▪ 细胞黏附 ▪ 细胞运动 信号通路应用 ▪ 分子转位 ▪ 质膜转位 ▪ 共定位分析 受体内化 ▪ GPCR信号转导 ▪ 微点发现
13
细胞形态
14
细胞骨架 F-actin
▪ In control cells the F-actin (red) pattern is fibrous, with a mixture of high, medium, and low intensities throughout the cell body
nuclei 20
细胞周期Cell Cycle BioApplication
Channel 1 Nucleus – DNA content
Channel 2 Phosphorylated Rb
Channel 3 Total Rb
对照
药物1
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Automatic Assignment of Cell Cycle Phase based on DNA Content
E2 (10-6M)
F2 (10-5M)
25
G2 (10-4M)
分子转位Translocation
通道
1 （蓝色）
2 (绿色)
靶标
细胞核
NFkB
标记物
分析区域
Hoechst 33342
基础目标
间接荧光标记
1° NFkB抗体； 2° Alexa Fluor 488
的2抗
Circ and Ring
Circ Region – blue Ring Region - from circ to Red