4基因组测序与序列组装
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几种不同生物基因组的测序
4.2.1基因组测序的策略
1) 作图测序 2) 随机测序
4.2.2 基因组测序的覆盖面
基因组测序覆盖面（coverage）:随机测序获得 的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，覆 盖面越大，遗漏的序列越少。 测序覆盖率计算, P定义为丢失的概率. P0=e-m, m为覆盖面, 即当量数 若m=1 P0=e-1=0.37 若m=5 P0=e-5=0.0067=0.67% 若m=10 P0=e-10=4.5 x 10-5 =0.000045=0.0045%
３浏览测序
是粗略分析初步测序结果从中寻找基因编码顺序的方法。
本章结束
３’外切酶活性 ５’外切酶活性
Klenow酶 加工性能差 sequence酶 加工效率高
制备单链ＤＮＡ的方法
１将DNA克隆到质粒载体中，样品为双链DNA，需变性处理 使双链DNA变为单链. 优点：可获得大量样品，操作简便，可双向测序. 缺点：制备的样品中可能有未纯化的DNA沾染，会干扰测序 反应. ２以M13载体克隆单链ＤＮＡ． M13载体是根据复制型M13基因组改进的双链DNA
4.2.3 间 隙 的 类 型
测序后将DNA顺序进行组装,会发现存在不 连续的区段.它们产生于: 1) 因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺 序,仍存在于克隆文库中, 这类间隙称为 序列间隙. 2) 因克隆载体自身的限制或DNA顺序特 殊的组成等原因造成某些顺序丢失或未 能克隆, 这类间隙称为物理间隙.
通用引物:克隆位点附 近载体上的一段顺序
(SP6,T7)
内部引物:DNA长度大于 750bp必须根据前面已 知顺序合成新的引物延 伸测序
化学降解法测序
基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学基 团再经化合物处理使ＤＮＡ分子在被修饰的核 苷酸位置降解。４种核苷酸Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ均 可分别修饰，分别降解，形成只差一个核苷酸 的降解ＤＮＡ群体。
毛细管电泳：采用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳， 一次可同时进行96次测序，大大提高测序效率（P62）。
自动化测序（荧光标记检测）
非常规DNA测序
光点测序（pyrosequencing）：该方法无须电泳及其他 分离程序,不必ddNTP终止反应，可一直合成延伸下去， 因此比链终止法更加迅速。原理：当每个配对的核苷酸 加入到正在生长的新链末端时，根据发出的信号直接判 读。 引物
(Sanger等，1977)
原理：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测 DNA分子的顺序，合成的互补单链可在不同位置随机终止 反应。
化学降解法（chemical degradation method）
(Maxam等，1977)
原理：双链DNA分子经化学试剂处理，可在特定的核苷酸 位点产生切口。用同位素标记碱基，以此确定顺序组成。
操作：双链DNA变性为单链DNA后（一端带标记
物），单一碱基的化学修饰后降解（控制修饰 剂浓度使每条单链只发生一处断裂），电泳后 带型分析。
注：不同核苷酸碱基的特异修饰方法见表
4.1(P59)。
自动化测序
链终止法采用放射性标记（ddNTP掺入同位素）， 自动化测序采用荧光标记．二者的不同之处有三：
-
N N O H H 2’ OH H N
O
-
O
-
O P O P O P O CH2 O O O H H 3’ H OH ATP ddATP
ddNTP(3’碳原子连接的都是Ｈ，不能形成磷酸二酯键)
链终止法对ＤＮＡ多聚酶的要求 １高酶活性 ２无５’ ３无３’
多聚酶在终止合成前多聚核苷酸分子 可延伸的长度.
顺序间隙缝合
物理 间隙 缝合
4.2.4 插入片段的两端测序
利用长度不同插入子克隆两端测序搭建支架
4.3 序列组装
4.3.1 作图法测序与序列组装 从上至下的策略—图位法测序
基因组顺序组装的概念定义
1)
2) 3)
4)
5)
BAC 末端顺序(BAC-end sequenced) 一个BAC克隆插入片 段两端的已测序的顺序,不包括内部顺序. 可用于确定BAC 的排列方向以及重叠群(contig)在支架(scaffold)中的排 列方向. 重叠群(contig) 一群相互重叠的克隆或DNA顺序,可以是 草图顺序或精确顺序(finished), 包括连续的(内部无间 隙)或不连续的(内部含间隙)DNA顺序,未锚定到染色体上. 草图顺序(draft sequence) 人类基因组测序计划定义为 经Phred Q20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA顺序. 含间隙或无间隙, 排列方向和位置未定. 完成顺序(finished sequence) 顺序差错率(错误碱基数) 低于0.01%的DNA序列, 排列方向确定,内部不含间隙, 一 般测序覆盖率在8-10个当量. 支架(scaffold) 一组已锚定在染色体上的重叠群, 内部 含间隙或不含间隙. 引自NCBI, Revised November 6, 2003
4.3.2 鸟枪法测序与序列组装 从下至上的策略—随机法测序
关于基因组测序顺序的概念
1) 草图顺序: draft sequence 2) 完成顺序: finished sequence
草图顺序
1) 达到普通质量但尚未完成的基因组DNA顺序, 其精确度高于90%.所处染色体位置已知,一 般长度约10kb. 2) 草图顺序可分为3个等级: Phase 0: 测序覆盖顺序一次的DNA序列; Phase 1: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向 未定. Phase 2: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向 已定.
优点:M13载体如同质粒DNA克隆载体一样操作,但M13载 体提供的是包装在噬菌体中的单链DNA样品,不用变性直 接用于测序. 缺点:若重组M13载体大于3kb,在扩增时容易发生丢失与 重排事件,只适用于小片段DNA.
３以噬粒(phagemid)克隆DNA 改造过的质粒克隆载体,含有2个复制起始点:一个是质 粒自身的,另一个来自单链DNA 噬菌体基因组的复制起 始点.当大肠杆菌细胞同时含有噬粒和辅助噬菌体可激
4.1
DNA测序的方法学 4.2 DNA顺序的组装 4.3 基因组测序的其他路线
4.1 DNA测序的方法学
4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4
链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
链终止法（the chain termination method）
wk.baidu.com
活噬菌体DNA复制产生含有单链的噬粒噬菌体.
优点:避免了M13系统的不稳定性,克隆片段≥10kb ４PCR产生单链ＤＮＡ
根据测序DNA两端顺序合成2个引物,其中一个引物连接到 磁珠上,PCR后利用吸磁的办法提纯扩增的单链DNA.
It is an original idea!
引物的顺序决定了ＤＮＡ测序的起点
完成顺序
1) 完成顺序系指已测序的, 每10000 个碱 基中出现一个差错, 且内部不存在间隙 的DNA顺序. 2) 完成顺序也称为Phase 3期顺序.
基因组测序的其他路线
１重要区域的优先测序
如人类主要组织相容性复合区（hMHC）的测序。
２ＥＳＴ测序
EST为探针很易从cDNA文库中筛选全长基因。
技术要点：
制备相同的单链模板DNA； 与一小段引物退火，形成 双链后起始新链的合成； DNA多聚酶催化，底物包括4种脱 氧核苷酸（dNTP) 及少量双脱氧核苷酸（ddNTP) ，合成的 新链终止于ddNTP．
双脱氧核苷酸ddNTP
链终止法对DNA多聚酶的要求
链终止法要求单链作为模板
NH 2 N O
模板DNA
图 解
＋ dATP ＋ dTTP
降解
降解
发光 降解 发光 GA G
＋
dGTP ＋ dCTP ＋ dATP ＋
非常规DNA测序
DNA芯片测序：将各种排列顺序的寡聚核苷酸点播
在面积很小的芯片上，每个点播的寡聚核苷酸在排 列的方阵中都有指定的位置。待测的DNA分子与芯 片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确定位置 发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸顺序 比对组装，拼接成完全的DNA顺序（P62）。
物理图绘制的四种方法?
①限制性作图（restriction mapping）是将限制性酶切 位点标定在DNA分子的相应位置 ②依靠克隆的基因组作图（clone-based mapping）根据 克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群，绘制物理 连锁图 ③荧光标记原位杂交（FISH fluorescent in situ hybridization ）将荧光标记的探针与染色体杂交确 定分子标记的所在位置 ④顺序标签位点作图（STS sequence tagged site） 通 过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区 段中
1）辐射杂种 两个标记滞留在同一杂种细胞中的比例与其之间的连 锁关系成正比. 2）克隆作图 作图试剂来自:全基因组DNA或单一染色体构建的基 因组文库,然后采取PCR检测STS的克隆,根据重叠的 STS标记可绘制克隆连锁图.
§4 基因组测序与序列组装
基因组测序的终极目标是获取生物完整 的DNA顺序,理想的状况是将物理图与遗传图 进行有机的整合,这样便于确定基因以及其 他重要的序列在DNA顺序中的位置。
⑴后者以荧光颜色作为标记颜色；⑵整个反应在一个试 管中进行,一个泳道同时判读4种碱基;⑶当新合成的终止 单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并 由电脑记录。
荧光标记法：不同的荧光色彩标记化合物可分别与四种 不同的ddNTP结合后通过荧光检测仪时激发出不同颜色的 光（如ddATP红光、如ddCTP蓝光、如ddTTP绿光、如 ddGTP黄光），因而可直接读出延伸链末端的ddNTP类型 （P61）。
局限性:每次可测定的DNA分子长度受到限制。
DNA
DNA芯片
杂交
共聚焦显微镜
ATAGGCAT TAGGCATA AGGCATAC …ATAGGCATAC…
4.2 基因组测序
1) 2) 3) 4) 4) 5) 大肠杆菌基因组测序----图位法 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 果蝇基因组测序---鸟枪法 人类基因组测序---图位法和鸟枪法 拟南芥基因组测序—图位法 水稻基因组测序---图位法和鸟枪法
什么是STS? STS物理图定位的方 法有几种分别是什么?
STS（sequence tagged site）是一小段长度在100500bp的DNA顺序，每个基因组仅1份拷贝，很易分辨。 当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这2个片段彼 此重叠。2个不同的STS出现在同一片段的机会取决于 它们在基因组中的位置靠得多近。
4.2.1基因组测序的策略
1) 作图测序 2) 随机测序
4.2.2 基因组测序的覆盖面
基因组测序覆盖面（coverage）:随机测序获得 的序列总长与单倍体基因组序列总长之比，覆 盖面越大，遗漏的序列越少。 测序覆盖率计算, P定义为丢失的概率. P0=e-m, m为覆盖面, 即当量数 若m=1 P0=e-1=0.37 若m=5 P0=e-5=0.0067=0.67% 若m=10 P0=e-10=4.5 x 10-5 =0.000045=0.0045%
３浏览测序
是粗略分析初步测序结果从中寻找基因编码顺序的方法。
本章结束
３’外切酶活性 ５’外切酶活性
Klenow酶 加工性能差 sequence酶 加工效率高
制备单链ＤＮＡ的方法
１将DNA克隆到质粒载体中，样品为双链DNA，需变性处理 使双链DNA变为单链. 优点：可获得大量样品，操作简便，可双向测序. 缺点：制备的样品中可能有未纯化的DNA沾染，会干扰测序 反应. ２以M13载体克隆单链ＤＮＡ． M13载体是根据复制型M13基因组改进的双链DNA
4.2.3 间 隙 的 类 型
测序后将DNA顺序进行组装,会发现存在不 连续的区段.它们产生于: 1) 因覆盖率的原因而留下的未能测序的顺 序,仍存在于克隆文库中, 这类间隙称为 序列间隙. 2) 因克隆载体自身的限制或DNA顺序特 殊的组成等原因造成某些顺序丢失或未 能克隆, 这类间隙称为物理间隙.
通用引物:克隆位点附 近载体上的一段顺序
(SP6,T7)
内部引物:DNA长度大于 750bp必须根据前面已 知顺序合成新的引物延 伸测序
化学降解法测序
基本原理:在选定的核苷酸碱基中引入化学基 团再经化合物处理使ＤＮＡ分子在被修饰的核 苷酸位置降解。４种核苷酸Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ均 可分别修饰，分别降解，形成只差一个核苷酸 的降解ＤＮＡ群体。
毛细管电泳：采用毛细管电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳， 一次可同时进行96次测序，大大提高测序效率（P62）。
自动化测序（荧光标记检测）
非常规DNA测序
光点测序（pyrosequencing）：该方法无须电泳及其他 分离程序,不必ddNTP终止反应，可一直合成延伸下去， 因此比链终止法更加迅速。原理：当每个配对的核苷酸 加入到正在生长的新链末端时，根据发出的信号直接判 读。 引物
(Sanger等，1977)
原理：通过合成与单链DNA互补的多核苷酸链来读取待测 DNA分子的顺序，合成的互补单链可在不同位置随机终止 反应。
化学降解法（chemical degradation method）
(Maxam等，1977)
原理：双链DNA分子经化学试剂处理，可在特定的核苷酸 位点产生切口。用同位素标记碱基，以此确定顺序组成。
操作：双链DNA变性为单链DNA后（一端带标记
物），单一碱基的化学修饰后降解（控制修饰 剂浓度使每条单链只发生一处断裂），电泳后 带型分析。
注：不同核苷酸碱基的特异修饰方法见表
4.1(P59)。
自动化测序
链终止法采用放射性标记（ddNTP掺入同位素）， 自动化测序采用荧光标记．二者的不同之处有三：
-
N N O H H 2’ OH H N
O
-
O
-
O P O P O P O CH2 O O O H H 3’ H OH ATP ddATP
ddNTP(3’碳原子连接的都是Ｈ，不能形成磷酸二酯键)
链终止法对ＤＮＡ多聚酶的要求 １高酶活性 ２无５’ ３无３’
多聚酶在终止合成前多聚核苷酸分子 可延伸的长度.
顺序间隙缝合
物理 间隙 缝合
4.2.4 插入片段的两端测序
利用长度不同插入子克隆两端测序搭建支架
4.3 序列组装
4.3.1 作图法测序与序列组装 从上至下的策略—图位法测序
基因组顺序组装的概念定义
1)
2) 3)
4)
5)
BAC 末端顺序(BAC-end sequenced) 一个BAC克隆插入片 段两端的已测序的顺序,不包括内部顺序. 可用于确定BAC 的排列方向以及重叠群(contig)在支架(scaffold)中的排 列方向. 重叠群(contig) 一群相互重叠的克隆或DNA顺序,可以是 草图顺序或精确顺序(finished), 包括连续的(内部无间 隙)或不连续的(内部含间隙)DNA顺序,未锚定到染色体上. 草图顺序(draft sequence) 人类基因组测序计划定义为 经Phred Q20软件认可覆盖测序克隆片段3-4倍的DNA顺序. 含间隙或无间隙, 排列方向和位置未定. 完成顺序(finished sequence) 顺序差错率(错误碱基数) 低于0.01%的DNA序列, 排列方向确定,内部不含间隙, 一 般测序覆盖率在8-10个当量. 支架(scaffold) 一组已锚定在染色体上的重叠群, 内部 含间隙或不含间隙. 引自NCBI, Revised November 6, 2003
4.3.2 鸟枪法测序与序列组装 从下至上的策略—随机法测序
关于基因组测序顺序的概念
1) 草图顺序: draft sequence 2) 完成顺序: finished sequence
草图顺序
1) 达到普通质量但尚未完成的基因组DNA顺序, 其精确度高于90%.所处染色体位置已知,一 般长度约10kb. 2) 草图顺序可分为3个等级: Phase 0: 测序覆盖顺序一次的DNA序列; Phase 1: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向 未定. Phase 2: 测序覆盖顺序4-10次的BAC克隆, BAC及内部片段的位置和排列方向 已定.
优点:M13载体如同质粒DNA克隆载体一样操作,但M13载 体提供的是包装在噬菌体中的单链DNA样品,不用变性直 接用于测序. 缺点:若重组M13载体大于3kb,在扩增时容易发生丢失与 重排事件,只适用于小片段DNA.
３以噬粒(phagemid)克隆DNA 改造过的质粒克隆载体,含有2个复制起始点:一个是质 粒自身的,另一个来自单链DNA 噬菌体基因组的复制起 始点.当大肠杆菌细胞同时含有噬粒和辅助噬菌体可激
4.1
DNA测序的方法学 4.2 DNA顺序的组装 4.3 基因组测序的其他路线
4.1 DNA测序的方法学
4.1.1 4.1.2 4.1.3 4.1.4
链终止法测序 化学降解法测序 自动化测序 非常规DNA测序
链终止法（the chain termination method）
wk.baidu.com
活噬菌体DNA复制产生含有单链的噬粒噬菌体.
优点:避免了M13系统的不稳定性,克隆片段≥10kb ４PCR产生单链ＤＮＡ
根据测序DNA两端顺序合成2个引物,其中一个引物连接到 磁珠上,PCR后利用吸磁的办法提纯扩增的单链DNA.
It is an original idea!
引物的顺序决定了ＤＮＡ测序的起点
完成顺序
1) 完成顺序系指已测序的, 每10000 个碱 基中出现一个差错, 且内部不存在间隙 的DNA顺序. 2) 完成顺序也称为Phase 3期顺序.
基因组测序的其他路线
１重要区域的优先测序
如人类主要组织相容性复合区（hMHC）的测序。
２ＥＳＴ测序
EST为探针很易从cDNA文库中筛选全长基因。
技术要点：
制备相同的单链模板DNA； 与一小段引物退火，形成 双链后起始新链的合成； DNA多聚酶催化，底物包括4种脱 氧核苷酸（dNTP) 及少量双脱氧核苷酸（ddNTP) ，合成的 新链终止于ddNTP．
双脱氧核苷酸ddNTP
链终止法对DNA多聚酶的要求
链终止法要求单链作为模板
NH 2 N O
模板DNA
图 解
＋ dATP ＋ dTTP
降解
降解
发光 降解 发光 GA G
＋
dGTP ＋ dCTP ＋ dATP ＋
非常规DNA测序
DNA芯片测序：将各种排列顺序的寡聚核苷酸点播
在面积很小的芯片上，每个点播的寡聚核苷酸在排 列的方阵中都有指定的位置。待测的DNA分子与芯 片温浴，凡是能杂交的寡聚核苷酸都会在确定位置 发出信号，然后根据获取的信息将寡聚核苷酸顺序 比对组装，拼接成完全的DNA顺序（P62）。
物理图绘制的四种方法?
①限制性作图（restriction mapping）是将限制性酶切 位点标定在DNA分子的相应位置 ②依靠克隆的基因组作图（clone-based mapping）根据 克隆的DNA片段之间的重叠顺序构建重叠群，绘制物理 连锁图 ③荧光标记原位杂交（FISH fluorescent in situ hybridization ）将荧光标记的探针与染色体杂交确 定分子标记的所在位置 ④顺序标签位点作图（STS sequence tagged site） 通 过PCR或分子杂交将小段DNA顺序定位在基因组的DNA区 段中
1）辐射杂种 两个标记滞留在同一杂种细胞中的比例与其之间的连 锁关系成正比. 2）克隆作图 作图试剂来自:全基因组DNA或单一染色体构建的基 因组文库,然后采取PCR检测STS的克隆,根据重叠的 STS标记可绘制克隆连锁图.
§4 基因组测序与序列组装
基因组测序的终极目标是获取生物完整 的DNA顺序,理想的状况是将物理图与遗传图 进行有机的整合,这样便于确定基因以及其 他重要的序列在DNA顺序中的位置。
⑴后者以荧光颜色作为标记颜色；⑵整个反应在一个试 管中进行,一个泳道同时判读4种碱基;⑶当新合成的终止 单链通过荧光监测仪时，可由光信号读出末端核苷酸并 由电脑记录。
荧光标记法：不同的荧光色彩标记化合物可分别与四种 不同的ddNTP结合后通过荧光检测仪时激发出不同颜色的 光（如ddATP红光、如ddCTP蓝光、如ddTTP绿光、如 ddGTP黄光），因而可直接读出延伸链末端的ddNTP类型 （P61）。
局限性:每次可测定的DNA分子长度受到限制。
DNA
DNA芯片
杂交
共聚焦显微镜
ATAGGCAT TAGGCATA AGGCATAC …ATAGGCATAC…
4.2 基因组测序
1) 2) 3) 4) 4) 5) 大肠杆菌基因组测序----图位法 流感嗜血杆菌基因组测序---鸟枪法 果蝇基因组测序---鸟枪法 人类基因组测序---图位法和鸟枪法 拟南芥基因组测序—图位法 水稻基因组测序---图位法和鸟枪法
什么是STS? STS物理图定位的方 法有几种分别是什么?
STS（sequence tagged site）是一小段长度在100500bp的DNA顺序，每个基因组仅1份拷贝，很易分辨。 当2个片段含有同一STS顺序时，可以确认这2个片段彼 此重叠。2个不同的STS出现在同一片段的机会取决于 它们在基因组中的位置靠得多近。