壳聚糖

6.体外细胞实验结果
使用倒置荧光显微镜观察叶酸−壳聚糖 纳米载体、壳聚糖纳米粒与表达有叶酸受 体的细胞之间的相互作用，结果见图6 和 图7.可以发现：细胞荧光效果明显，且荧 光强度与纳米粒同细胞相互作用时间成正 比.
(a) 自然光；(b) 自然光+荧光 图6 荧光标记的叶酸−壳聚糖纳米粒与HepG2 细胞相互作 用的倒置荧光显微镜像
(4) 与HeLa 细胞共培养时细胞荧光效果明显， 且荧光强度同纳米粒与细胞相互作用时间 成正比。 (5) 建立并完善了叶酸修饰壳聚糖纳米载体的 制备工艺，为后续靶向性纳米制剂的研制 提供了技术手段。
图 7 荧光标记的壳聚糖纳米粒与HepG2 细胞 相互作用的倒置荧光显微镜像
实验结果表明：叶酸活性酯用量和反 应温度及试剂滴加速度是影响偶联比的主 要因素；在叶酸活性酯与壳聚糖用量质量 比为1‫׃‬1，反应温度30℃，滴加速度为 2mL/min，反应时间为12 h 的条件下可得 到偶联稳定的叶酸偶联壳聚糖；所制得的 纳米粒粒径为290 nm，形态规则，细胞荧 光效果明显；此方法能用于制备荧光标记 的叶酸修饰壳聚糖纳米粒载体。
壳聚糖
报告人 肖春羽 2010.11.
1. 壳聚糖简介
2. 壳聚糖的作用 3. 荧光标记的叶酸修饰壳聚糖
纳米载体研制
中文名称：壳聚糖
英文名称：chitosan 简 称：cs
化学名称：聚葡萄糖胺(1-4)-2-氨基-B-D葡萄糖 分 子 式 ：C6H11NO4
壳聚糖是由自然界广泛存在的几 丁质(chitin)经过脱乙酰作用得到的， 是天然界多糖中唯一的碱性多糖。壳 聚糖为阳离子聚合体，不溶于普通有 机溶剂，在碱液中稳定，有很强的亲 水性，可在稀盐酸,稀醋酸溶液中膨胀 并形成凝胶，依此特性可制成各种缓 释和控释制剂0 cm−1 处有吸收峰
图2 叶酸活性酯的红外光谱
—COOH 在1 692 cm−1 处有吸收峰
图3 叶酸偶联壳聚糖的红外光谱
在1 562 cm−1 处出现了新的强吸收峰
4.形态观察及粒径测定
取适量叶酸偶联壳聚糖纳米粒混悬液 滴加于云母片上，用原子力显微镜观察其 形态，用激光粒度分析仪测定纳米粒的粒 径。
图4 荧光标记的叶酸−壳聚糖纳米粒的粒径曲线 由图可见：荧光标记的叶酸−壳聚糖纳米粒的颗粒粒 径比较集中，无颗粒团聚现象，平均粒径约为290nm
图5 荧光标记的叶酸−壳聚糖纳米粒的原子力 显微镜扫描像 由图可见：其颗粒形态规则，颗粒 大小比较均匀，无颗粒团聚现象。
5.体外细胞实验 取肝癌HepG2 细胞，在含有10%的小牛血清 的1640 培养基中连续培养。培养环境为：5%(体 积分数)CO2，37 ℃。取对数生长期细胞，胰酶 消化后在培养皿中的盖玻片上接种，置于培养箱 中培养24 h。待培养皿中的细胞贴壁生长后，吸 去培养基。用PBS 清洗3 次。加入荧光标记的叶 酸偶联壳聚糖纳米粒悬浮液和壳聚糖纳米粒悬浮 液，于37 ℃培养24 h，用PBS 冲洗细胞3 次，用 小镊子取出盖玻片，放在预先洗净的载玻片上， 用抗萃灭剂封片，用荧光显微镜进行观察。
荧光标记的叶酸 修饰壳聚糖纳米载体研制
实验方法：
通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反 应，使叶酸与壳聚糖偶联。将异硫氰基荧 光素(FITC)与叶酸偶联壳聚糖进行化学嫁接， 以离子交联法制成具有荧光的叶酸偶联壳 聚糖纳米粒，并与肝癌HepG2 细胞进行体 外细胞实验。
1.叶酸偶联壳聚糖的制备
称取壳聚糖160 mg，溶于40 mL 醋酸 −醋酸钠缓冲液(pH 4.6)中，在磁力搅拌条 件下以2 mL/min 的速度缓慢加入8 mL 叶 酸活性酯的二甲基亚砜（DMSO） 溶液 (20mg/mL)，于30 ℃反应12 h，然后，用 10 moL/L NaOH调pH 值至9，离心，用蒸 馏水洗涤数遍后，重新溶于2%醋酸水溶液， 得到叶酸偶联壳聚糖溶液。
壳聚糖具有很好的生物相容性，可 被体内多种酶类降解，降解产物安全 无毒，并能被生物体完全吸收。结合 纳米技术可以制成纳米尺寸的壳聚糖 核酸复合体，作为基因转运载体，将 核酸包裹，保护核酸不易被核酸酶降 解。
壳聚糖的作用：
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 抑制细菌 延缓衰老 止血促愈 抗疲劳 降血脂 抗肿瘤 免疫活性 基因载体
结论：
(1) 壳聚糖上的2 个活性基团可用于化学修饰： 一个是脱去乙酞基的位点上的游离氨基， 另一个是脱去乙酞基的位点上的羟基。 (2) 通过壳聚糖主链上的游离氨基与叶酸上的 羧基形成酞胺键，达到壳聚糖化学修饰的 目的。
(3) 由于壳聚糖的高分子特性，其水溶性差， 只能在酸性水溶液中溶解，叶酸又无法溶 于酸性水溶液，所以，采用先将壳聚糖与 DMSO 中的叶酸偶联，后进行荧光标记及 采用离子交联反应法制备纳米粒的方法， 制备了具有荧光标记的叶酸壳聚糖纳米粒， 用异硫氰酸荧光素标记壳聚糖和叶酸偶联 壳聚糖，以表面表达有叶酸受体的HepG2 细胞为模型细胞，进行细胞摄取机理研究。
2.荧光标记的叶酸−壳聚糖纳米粒的制备
称取10 mg 异硫氰酸荧光素(FITC)，溶于10 mL无水乙醇中，在磁力搅拌条件下逐滴加入到 20 mL 叶酸−壳聚糖的醋酸溶液中，避光反应4 h， 使FITC 上的碳原子与壳聚糖上的氨基反应以便进 行标记。用10 mol/L NaOH 调节pH 值至9。离心， 用蒸馏水洗涤，直至滤液澄清呈无色为止。将沉 淀重新用2%醋酸溶液溶解，用10 mol/L NaOH 调节pH 值至5，在磁力搅拌条件下逐滴加入10 mL多聚磷酸钠（TPP ）溶液(2 g/L)。反应 20min 后得到荧光标记的叶酸−壳聚糖纳米粒。
3.红外光谱分析
采用红外光谱仪分析叶酸与壳聚糖的 偶联情况。图1~3 所示分别为壳聚糖、叶 酸活性脂和叶酸偶联壳聚糖的红外光谱。 从叶酸偶联壳聚糖的红外光谱可以看出(图 3)：—NH2 在1 640 cm−1 处的吸收峰(见图 1)和—COOH 在1 692 cm−1 处的吸收峰(见 图2)消失，在1 562 cm−1 处出现了新的强 吸收峰，说明壳聚糖上的氨基与叶酸上的 羧基形成了酰胺键，两者成功偶联。