瑞氏-吉姆萨染液配法

英文拼写 Wright's stain

是由酸性染料伊红和碱性染料美蓝组成的复合染料，溶于甲醇。后解离为带正电的美蓝和带负电的伊红离子。

使用方法

瑞氏（Wright's staim；美蓝－伊红Ｙ）染色：

1．瑞氏染料是由碱性染料美蓝（Methvlem blue）和酸性染料黄色伊红（Eostm Y）合称伊红美蓝染料即瑞氏（美蓝－伊红Ｙ）染料。

2．用甲醇作瑞氏染料溶剂，即成瑞氏染液。甲醇是瑞氏染料良好溶剂，有两种作用：

（1）甲醇使瑞氏染料中美蓝（M）与伊红（E）在溶液中离解，可使细胞成分选择性吸附其中的有色物质而着色。

甲醇

ME（瑞氏染料）----→M+ + E-

在配制的瑞氏染液中美蓝如放置过久即可氧化而含有天青，美蓝天青与伊红化合物能使核染成紫红色，但不能使胞浆染为蓝色，多余美蓝就可以使胞浆染成蓝色，染色主要是化学作用，是离子彼此结合的反应。

（2）甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。

染液配制

(1) 瑞氏染液配制：

瑞氏染料 830gm或1g

甲醇（AR）500ml或600ml

○先称干燥（事先放入温箱干燥过夜）瑞氏染料放置乳钵内，用乳棒轻轻敲碎染料成粉末，再行研磨至听不到研芝麻声即呈细粉末，加少许甘油或甲醇溶解研磨，使染料在乳缸内显“一面镜”光泽，而无染料粉粒沉着。

○再加较多量甲醇研磨呈一面镜光亮，静置片刻，将上层液体倒入一清洁储存瓶内（最好用甲醇空瓶），再加甲醇研磨，重复数次，至乳钵内染料及甲醇用完为止，摇匀，密封瓶口。

○存室温暗处，储存愈久，则染料溶解、分解就越好，一般储存3个月以上为佳。

(2) 缓冲液：

●缓冲液作用：

○染色对氢离子浓度是十分敏感的，据观察pH值的改变，可使蛋白质与染料形成的化合物重新离解。

○缓冲液须保持一定的pH使染色稳定，PBS的pH 一般在6.4~6.8，

○偏碱性染料可与缓冲液中酸基起中和作用，偏酸性染料则与缓冲液中的碱基起中和作用，使pH恒定。

缓冲液配制

（pH6.4~6.8，弱酸性）：

配方1 ：配方2：

1% KH2PO4 30ml M/15 KH2PO4 73.5 ml

1% Na2HPO4 20ml M/15 Na2HPO4 26.5ml

H2O(新鲜) 加至1000ml

置室温黑暗处，瓶口密封，防止霉菌污染，如有污染则应报废。

姬姆萨（Giemsa's stain；天青-伊红）染色

1．姬姆萨染料是伊红(AzurII Eqsin)和天青（蓝）2号合成的。

2．姬姆萨染料（Giemsa, 天青-伊红）染液配制：

姬姆萨染料（粉末）0.5g或7.5g

甲醇（AR）33ml 或500ml

甘油（AR）33ml或500ml

●先将姬姆萨染料放入乳钵中，逐渐倒甘油研磨溶于甘油中，置于56℃水温箱内，90～120分钟，然后加入甲醇，摇匀后放置数天，过滤后或不过滤即可使用。此染液放置室温阴暗处，时间越长越好。

●使用染液可临时配置）：姬姆萨染液1ml，加DDH2O10ml混匀。即可使用。

染色步骤

（1）先用甲醇固定2～3分钟。

（2）将血或骨髓涂片放置姬姆萨使用液15～30分钟。

（3）涂片用自来水冲洗，在室温中干燥待查。

染液鉴定

瑞氏或姬姆萨染色液鉴定：刚配好或放置一个月以上的染液可进行下列鉴定：

1．取1滴染液于乳白玻板上，自行迅速扩散开，其颜色变紫红色，且有伪足形成。

2．取1滴染液加1滴缓冲液，染液由深蓝色立即变为紫红色。

3．取血片或骨髓片进行试染检查，观察染色后各类细胞的胞核、胞浆及颗粒着色情况，pH是否合适及染色合适时间。如有上述变化，表明染液合格，可供使用。

混合染色

瑞氏染色(Wright's)-姬姆萨（Giemsa's）混合染色：

●瑞氏染色的染料配方浓度对细胞核着色程度适中,细胞核结构和色泽清晰艳丽,对核结构的识别较佳,但对胞浆着色偏酸,色泽偏红,对细胞浆内颗粒特别是嗜天青颗粒及嗜中性颗粒着色较差。

●姬姆萨染色对胞浆着色能较好的显示胞浆的嗜碱性程度,特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰, 色泽纯正,而对胞核着色偏深,核结构显示较差。

●故采用以瑞氏染液为主，姬姆萨染液为辅的混合染色。

染色步骤:

1. 先用瑞氏染液将涂膜面充分覆盖；

2. 稍等片刻再加姬姆萨染液2-3滴加减(根据涂片上细胞多少及增升程度酌情而定)；

3. 稍等1-2分钟后,再加磷酸盐缓冲液,加时应缓慢地一滴一滴加在涂片膜上,直至膜面上染色液形成表面张力而终止染色液加入；

4. 染色30-40分钟；

5. 分色：用自来水缓缓冲洗至少3分钟以上,待干，勿用滤纸吸干,以免滤纸纤维污染涂片。

吉姆萨染液配法：

以1g的姬姆色素染料加入66ml甘油，混匀，60度保温溶解两小时，再加入66ml甲醇混匀，即配成姬姆色素原液，此原液用前用PBS（6.8）稀释十倍左右就可以使用（此为姬姆萨工作液）。工作液可保存一个月左右。

1．贮备液

Giemsa粉1g

纯甘油66ml

甲醇66ml

先将Giemsa粉置于研钵中加少量甘油，充分研磨，呈无颗粒的糊状。再将全部甘油加入，放入56℃温箱中2小时，然后加入甲醇，保存于茶色瓶中。一般两周后使用为好。

2．工作液

临用时将贮备液与pH6.8的磷酸缓冲液按照1:20混合。

警告：Giemsa有毒、易燃、易挥发性，请勿靠近火源、撞击。请勿与人体直接接触

吉姆萨染色步骤

根据需要量，配好工作液，此工作液常温可保存两周。按常规方法制备血涂片，待血膜干后,用甲醇固定 2 ～ 3 分钟；将血涂片或骨髓涂片放置染色架上，滴加稀释好的染色液，使覆盖全部血膜，室温染色15～30分钟。用自来水缓慢从玻片一端冲洗（注意勿先倒去染液或直接对血膜冲洗），凉干后镜检。