10乳酸脱氢酶活力测定谷丙转氨酶活力测定

实验影响因素
Ø 2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成本腙，包括底物 中的a-酮戊二酸，因此影响测定结果。但因其量不多，加之对 520nm的吸光度影响远不如丙酮酸生成的苯腙硝醌化合物强，所 以可通过在标曲制作时，加入一定量的底物，抵消a-酮戊二酸的 影响
Ø 测定活力时，应事先把底物、血清在37℃预热; 实验过程中，在 加入底物后，应准确计时
Ø 本实验测乳酸脱氢酶活力，是在一定条件下，向含丙 酮酸及NADH的溶液中，加入一定量LDH提取液，观 察NADH在反应过程中340nm 处光吸收减少值，减少 越多，则LDH活力越高。
Ø 其活力单位定义是：在25℃，pH7.5条件下每分钟A340 下降1.0的酶量为1个单位。
实 验 步 骤-- LDH测定
实 验 步 骤 2 –测定GPT
试剂(ml)
测定管
对照管
鱼肉肌肉匀浆
0.25
0.25
GPT测定底物溶液
0.5
37℃ 30min
2，4-二硝基苯肼
0.5
0.5
GPT测定底物溶液
0.5
37℃ 20min
0.4M NaOH
5
5
室温10min,以标准曲线零号管调零,测A520,查标曲得出丙酮酸微克数
GPT活力单位（U）=（测定管微克数-对照管微克数）/（0.25×0.5）
★37℃水浴中预热血清及底物溶液 ★与标准曲线同时做
思考题
ü 简述测定酶活力的基本原理； ü 测定酶活力的时候，为什么要对试剂配制、试剂
用量、血清用量、温度和作用时间有严格控制？
实验十 乳酸脱氢酶活力测定 谷丙转氨酶活力测定
(1) 了解LDH和SGPT活性测定原理 (2) 学习用比色法测定酶活性的方法
实 验 原 理 -- LDH测定法
Ø 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）是糖代谢途径的 关键酶之一，可催化乳酸脱氢产生丙酮酸的可逆反应
Ø NAD+ 在260nm, NADH在340nm处有各自的最大吸收峰，以 NAD+为辅酶的各种脱氢酶类都可通过340nm光吸收值的改 变，定量测定酶活力，如苹果酸脱氢酶、醇脱氢酶、醛脱 氢酶等
Ø GPT 能够催化将氨基从丙氨酸转移到a-酮戊二酸上的转氨基反应。
丙酮酸可与2,4二硝基苯肼（终止和显色作用）发生加成反应，生 成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，进而在碱性环境Hale Waihona Puke Baidu生成红棕色的苯腙硝醌 化合物，其颜色的深浅在一定范围内与丙酮酸的生成量，即与GPT活性 的高低成正比关系。
可通过测定520nm处的光吸收值，绘制标准曲线，得出血清中GPT 的活性。
磷酸缓冲液
0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0
37℃ 10min
2，4-二硝基苯肼 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
37℃ 20min
0.4M NaOH
5
5
5
5
5
5
室温 10min， 测A520
以空白管调零,以各管A520为纵坐标,丙酮酸的 mg 数为横坐标,做标准曲线
37℃水浴中预热反应溶液
Ø 25℃水浴中预热丙酮酸钠溶液及NADH溶液 Ø 紫外分光光度计340nm处，用0.1M K2HPO4-KH2PO4调零 Ø 在另一个比色杯中依次加入丙酮酸钠溶液2.9ml, NADH溶液
0.1ml，摇匀后，测定A340 Ø 取出比色杯加入酶液10 ml，立即计时，摇匀后，每隔0.5min
测一次A340，连续测定3min。 Ø 以 A340对时间作图，取反应最初线性部分，计算每分钟A340减
少值∆A340 * 酶液的稀释度及加入量应控制每分钟A340下降值在0.1－
0.2之间，以减少实验误差
数据处理
计算每毫升组织提取液中LDH活力单位：
LDH活力单位(U)/ml 提取液=
∆ A340×稀释倍数
酶液加入量(10 ml)×10-3
实 验 原 理 -- GPT测定法
Ø 谷丙转氨酶（Alanine transaminase or glutamic-pyruvic transaminase, ALT or GPT）主要存在于肝细胞浆内，其细胞内浓度高于血清中 1000-3000倍。只要有1%的肝细胞坏死，就可以使血清酶增高一倍。 因此，GPT被WHO推荐为肝功能损害最敏感的检测指标。
Ø 丙氨酸应使用化学合成的DL型，L型为生物活性形式，如为L型, 用量减半
Ø 溶血样品中血细胞内的转氨酶会释放入血清，从而影响测定结果
实 验 步 骤 1 --标准曲线
管号
试剂(ml)
0
1
2
3
4
5
丙酮酸标准液 （4mM)
0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
SGPT测定底物溶液 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5