DNA的细胞化学——Feulgen反应

DNA的细胞化学——Feulgen反应核酸是细胞中的重要组分，主要包括DNA和RNA。DNA是遗传信息的载体，主要存在于细胞核中；RNA传递DNA的遗传信息，指导细胞合成各种蛋白质。核酸的细胞化学研究已有近一个世纪的历史，1924年Feulgen和Rossenbeck于1924年创立显示DNA的特异性反应，1940年Brachet发明了甲基绿一派洛宁染色方法用以区别细胞中的DNA和RNA。这些经典方法目前仍被广泛应用，并得到不断改进和发展。研究细胞中核酸的含量及其动态变化，对于理解生长、发育、分化及凋亡等生物学基本问题具有重要的价值。

孚尔根反应(Feulgen reaction)是特异性显示DNA的最经典方法，得到了非常广泛的应用。其原理是DNA经过稀盐酸水解后的嘌呤碱和脱氧核糖之间的键打开，脱氧核糖的C 端形成游离的醛基。游离的醛基再同Schiff试剂的无色品红反应形成紫红色化合物，使细胞内含有DNA的部位呈现紫红色阳性反应。

甲基绿和派洛宁是2种碱性染色料，二者分别属于三芳基甲烷和氧杂蒽衍生物，与酸性的核酸具有亲和力，可以形成盐键而呈现出特殊的颜色反应。在pH4.6时甲基绿与派洛宁跟核酸发生竞争性结合。甲基绿分子具有2个正电荷，与聚合程度高的DNA具有较强的亲和力，与DNA双螺旋外侧的磷酸根基团结合从而阻止派洛宁从碱基之间插入，甲基绿与DNA的结合产物呈绿色；派洛宁只有1个正电荷，与低聚分子RNA具有较强的亲和力，中和RNA的磷酸基团，阻止甲基绿染色，派洛宁与RNA的结合物呈红色。根据颜色的部位可以判断DNA和RNA的定位并且判断两种核酸的相对含量。这一反应对pH敏感，脱水过程、染料的纯度和染料的结合力都影响到染色效果。

【实验目的】

学习DNA的Feulgen染色方法，并了解Feulgen反应原理及其DNA在细胞中的分布。

掌握甲基绿-派洛宁法（methyl green-pyronin method）并了解DNA和RNA在细胞中的分布。

【实验器材、材料和药品】

1．器材

显微镜、剪刀、镊子、解剖针、染色缸、载玻片、盖玻片、吸水纸、恒温水浴箱、小烧杯（10ml）

2．材料

洋葱鳞茎

3．试剂及其配制

Carnoy固定液：3份95%乙醇：1份冰醋酸

Schiff试剂：称取lg碱性品红(basicfuchsin)于250 ml的烧杯中，加入200ml刚煮

沸的蒸馏水，充分搅拌溶解，待溶液冷却到50℃时，过滤到磨口棕色瓶中，加入1mol/L HCl20 ml。冷却到25℃时加入l g偏重亚硫酸钾(K2S2O5)或偏重亚硫酸钠(NaS205)，充分振荡后盖紧瓶塞。次日取出，呈淡黄色或近于无色，加中性活性炭O.5 g，剧烈振荡1min。过滤后即得无色品红。保存时需盖紧瓶塞，外包黑纸，储存于4℃冰箱中(可保存数月或更长时间)。如液体变红则不宜再使用。

1mol/L HCl：取浓盐酸8.25 ml加100ml的蒸馏水。

亚硫酸水溶液（10%NaS2O5）：10%NaS2O5水溶液5ml，蒸馏水100ml，1mol/L HCl 5ml，现配现用。

0.2mol／L醋酸缓冲液(pH值4.8):取1.2 ml冰醋酸加蒸馏水100ml混匀。再称取2.72 g醋酸纳(NaAc.2H20)溶于100 ml蒸馏水中，使用时两种液体按2:3比例混合。

2%甲基绿染液: 称取2.0g去杂质甲基绿粉溶于100ml 0.2mo1/L的醋酸缓冲液中即可。甲基绿中往往混有影响染色效果的甲基紫，应预先除去。方法是将甲基绿溶于蒸馏水中。放在分液漏斗中加足量的氯仿用力震荡后静置，弃去含有甲基紫的氯仿，再加氯仿反复几次直到氯仿中无甲基紫为止，最后放入40℃温箱中干燥备用。

1％哌洛宁溶液：称取1 g派洛宁溶于100ml的0.2 mo1/L醋酸缓冲液中混匀。

甲基绿-派洛宁混合染液：将2％甲基绿和l％派洛宁以5：2的比例混合即可。

【实验方法和步骤】

孚尔根反应(Feulgen reaction)

取材：取洋葱根尖和洋葱表皮于1N的盐酸中浸1min。

水解：将材料放入预热至600C的1N盐酸中水解8min。

染色：转入Schiff试剂中，在常温下染色30分钟，根尖前端变为深红色

漂洗：在新配制亚硫酸水中洗两次，每次1min；漂洗2min后，在载玻片上切下深红色根尖备用。

压片：加一滴45%的醋酸在载玻片上，将根尖放入醋酸中，盖上盖玻片压片。

观察：有DNA的细胞核和染色体呈红色，其余部分无明显颜色。

Unaa法

取材：用小镊子撕取一小块洋葱内表皮，置于载玻片上。

染色：用吸管吸取甲基绿一派洛宁混合液，滴一滴在洋葱表皮上，染色30～40min。

冲洗：吸一滴蒸馏水冲洗洋葱表皮，并立即用吸水纸吸干以防派洛宁脱色。

观察：盖上盖玻片后镜检，可见富含RNA的细胞质被染成红色，富含DNA的核染成绿色。

【作业与思考题】

1．Feulgen反应中，为什么要用HCl水解？

2．比较两种显示核酸方法的优点。

3．绘图描述所观察到的结果。

4．根据实验观察，说明DNA和RNA主要分布在哪些部位？