生物学基因克隆的载体
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杂交探针 体外翻译 体外剪切反应
4、T载体 • pMD18-T Vector 高效克隆PCR产物（TA
Cloning）的专用载体，由pUC18载体改建而成
• 在 pUC18载体的MCS位点处的Xbal和Sal识别位 点之间插入EcoRV识别位点， 用EcoRV进行酶 切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。
• 大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在 PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性
5、E.Coli的表达载体 • 表达载体和克隆载体的主要区别：
强启动子和终止序列 • E.Coli：SD序列
真核生物基因在原核生物E.Coli中表达 • 转录 • 翻译 • 翻译后修饰
• 诱导表达和分泌表达
PBV221限制性内切酶图谱（30 ℃ / 42℃ ）
信号肽 一般特征： 含13-26个氨基酸残基， 在或靠近其N端有 一至多个带正电荷的 氨基酸， 在中部为由10-15个氨基酸 （大部或全部是疏水性的） 组成的疏水核
pTA1529质粒含大肠杆菌phoA基因的启动子和信号肽序列
第二节 λ噬菌体载体
1、λ噬菌体的特性
• 48.5 Kb 线性双链DNA
3、噬菌粒（phagemid）： 带有丝状噬菌体复制起点的质粒
• 可容纳较长的外源DNA片段（约10Kb）
• 在具有ColE1复制起点及抗生素选择标记的质 粒上加上单拷贝的丝状噬菌体主要基因间隔区
噬菌粒图解及克隆位点
• 超感染
ຫໍສະໝຸດ Baidu
• 如何保证子代病毒正链DNA主要来自噬菌粒基 因组？
噬菌粒中含有来自野生型M13 DNA的基因间隔区 辅助噬菌体（M13K07）基因组中带有来自M13载体 的基因间隔区
注意这些琥珀突变抑制基因的作用不能互相代替
• 大容量
减少构建和筛选的重组克隆数 多轮筛选
• λ噬菌体载体容量有限
当噬菌体基因组DNA的长度大于野生型λ噬菌体基因 组的105%或小于野生型λ噬菌体基因组的78%时，其存 活力剧降
第三节 粘质粒载体
• 柯斯质粒载体（35-45Kb） cos site-carring plasmid 带有粘性末端位点（cos）的质粒
使用双cos位点载体c2RB进行的粘质粒克隆
第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒
1、 M13噬菌体的特征
• M13、f1和fd长度为6.4Kb，单链环状DNA分 子（正义DNA基因组）
• 仅有的病毒基因组90%以上都编码蛋白质，10 个基因中大多数仅以数个核苷酸相隔，仅有两 个较长的基因间隔区。
• 复制 RF 200个拷贝/细胞 1000个子代噬菌体颗粒/ 每个细胞每个世代
乳糖操纵子模型
• IPTG 非代谢诱导物
• Xgal（无色） β-半乳糖苷酶 半乳糖+5-溴-4-氯靛蓝（深蓝色） β-半乳糖苷酶Xgal显色反应检测法
• 质粒 编码β-半乳糖苷酶氨基末端（ α –肽段）
• 宿主细胞 编码缺陷型β-半乳糖苷酶（失去正 常的氨基末端）
• 单独都不能产生有活性的β-半乳糖苷酶 两者结合在一起，才能形成有功能的β-半乳糖 苷酶（α互补）
2、 M13噬菌体载体 • 丝状噬菌体的所有基因均为必需基因，
外源基因放在哪里？ 基因间隔区 基因Ⅱ与基因Ⅳ
基因Ⅷ与基因Ⅲ
重组操作 双链DNA
单链DNA 可用于DNA序列分析和位点特异性突变的研究
M13mp18和M13mp19载体的限制酶切图
• 主要不足之处： 易产生外源DNA片段的部分缺失，且外源DNA 越大其缺失频率越高，一般情况下其有效的最 大克隆能力仅1500bp
Λgt11载体的限制性酶切位点
利用特异性抗体作为探针筛选Λgt11表达文库
• 插入位点位于LacZ基因的C末端，可作为β-半 乳糖苷酶融合蛋白表达； 可用抗体探针筛选
• 蓝白斑筛选
• 温度敏感诱导表达
• 裂解基因中的琥珀突变
• UAG UAA UGA
琥珀型 赭石型 乳白型
amber ochre opal
• 无义突变（nonsense） 使蛋白质长度提前终止，引起多肽长度变化
• 抑制基因 编码生成突变的tRNA（反密码子突变或其它位置突 变），识别无义密码子，但携带氨基酸。
• 某些载体的宿主菌带有一个或者两个很强的琥 珀突变抑制基因 SupE 在UAG密码子的位置上加上谷氨酰胺 SupF 在UAG密码子的位置上加上酪氨酸
• lacZ’内，具有一段多克隆位点序列（MCS） 在正常情况下，插入到MCS的外源DNA片段， 都会阻断α-肽链的合成，因此含有重组质粒载 体的克隆是无色的，它可以与含有非重组质粒 载体的克隆形成的蓝色“背景”明显地区别开 来
3、比较pGEM和pUC18/19
• 含有噬菌体的启动子，可合成RNA • 用途：
• 在病毒颗粒内线性，两端单链互补被称作 cos末端(cos end)
• 一旦进入细胞，两个cos末端就会迅速相互结合， 形成有缺口的环状基因组，细胞的DNA连接酶 可以修补该缺口
• 溶源 寄主细胞仍然存活着并持续地进行细胞分裂， 不产生子代噬菌体颗粒
• 溶菌 寄主细胞因裂解而致死，释放出许多噬菌体颗 粒
λDNA限制图谱
2、Charon系列载体 构建基因组文库
Charon28的限制性酶切位点（5-24Kb）
3、EMBL系列载体 构建基因组文库
MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ
EMBL3和EMBL4的限制性酶切位点（23Kb）
4、λgt系列载体 构建cDNA文库（6-8.2Kb)） 表达
带pMBI（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所 产生的转录物的方向及其粗略大小
质粒不亲和现象图解
2、比较pBR322和pUC18/19
pBR322质粒限制性内切酶图谱
pUC18/19质粒的限制性内切酶图谱
pUC18/19质粒的多克隆位点
• 多克隆位点 • 筛选标记 α互补 • 拷贝数 • 分子量
第一节 质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 第三节 粘质粒载体 第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒 第五节 真核细胞用载体 第六节 人工染色体
第一节 质粒载体
1、一般特性 • 双链闭合环状 • 松弛型质粒/严紧型质粒
氯霉素、壮观霉素
• ColE1复制起点质粒的复制调控 • 质粒的不相容性
利用同一复制系统的不同质粒不能稳定共存的现象
4、T载体 • pMD18-T Vector 高效克隆PCR产物（TA
Cloning）的专用载体，由pUC18载体改建而成
• 在 pUC18载体的MCS位点处的Xbal和Sal识别位 点之间插入EcoRV识别位点， 用EcoRV进行酶 切反应后，再在两侧的3’端添加“T”而成。
• 大部分耐热性DNA聚合酶反应时都有在 PCR产 物的3’末端添加一个“A”的特性
5、E.Coli的表达载体 • 表达载体和克隆载体的主要区别：
强启动子和终止序列 • E.Coli：SD序列
真核生物基因在原核生物E.Coli中表达 • 转录 • 翻译 • 翻译后修饰
• 诱导表达和分泌表达
PBV221限制性内切酶图谱（30 ℃ / 42℃ ）
信号肽 一般特征： 含13-26个氨基酸残基， 在或靠近其N端有 一至多个带正电荷的 氨基酸， 在中部为由10-15个氨基酸 （大部或全部是疏水性的） 组成的疏水核
pTA1529质粒含大肠杆菌phoA基因的启动子和信号肽序列
第二节 λ噬菌体载体
1、λ噬菌体的特性
• 48.5 Kb 线性双链DNA
3、噬菌粒（phagemid）： 带有丝状噬菌体复制起点的质粒
• 可容纳较长的外源DNA片段（约10Kb）
• 在具有ColE1复制起点及抗生素选择标记的质 粒上加上单拷贝的丝状噬菌体主要基因间隔区
噬菌粒图解及克隆位点
• 超感染
ຫໍສະໝຸດ Baidu
• 如何保证子代病毒正链DNA主要来自噬菌粒基 因组？
噬菌粒中含有来自野生型M13 DNA的基因间隔区 辅助噬菌体（M13K07）基因组中带有来自M13载体 的基因间隔区
注意这些琥珀突变抑制基因的作用不能互相代替
• 大容量
减少构建和筛选的重组克隆数 多轮筛选
• λ噬菌体载体容量有限
当噬菌体基因组DNA的长度大于野生型λ噬菌体基因 组的105%或小于野生型λ噬菌体基因组的78%时，其存 活力剧降
第三节 粘质粒载体
• 柯斯质粒载体（35-45Kb） cos site-carring plasmid 带有粘性末端位点（cos）的质粒
使用双cos位点载体c2RB进行的粘质粒克隆
第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒
1、 M13噬菌体的特征
• M13、f1和fd长度为6.4Kb，单链环状DNA分 子（正义DNA基因组）
• 仅有的病毒基因组90%以上都编码蛋白质，10 个基因中大多数仅以数个核苷酸相隔，仅有两 个较长的基因间隔区。
• 复制 RF 200个拷贝/细胞 1000个子代噬菌体颗粒/ 每个细胞每个世代
乳糖操纵子模型
• IPTG 非代谢诱导物
• Xgal（无色） β-半乳糖苷酶 半乳糖+5-溴-4-氯靛蓝（深蓝色） β-半乳糖苷酶Xgal显色反应检测法
• 质粒 编码β-半乳糖苷酶氨基末端（ α –肽段）
• 宿主细胞 编码缺陷型β-半乳糖苷酶（失去正 常的氨基末端）
• 单独都不能产生有活性的β-半乳糖苷酶 两者结合在一起，才能形成有功能的β-半乳糖 苷酶（α互补）
2、 M13噬菌体载体 • 丝状噬菌体的所有基因均为必需基因，
外源基因放在哪里？ 基因间隔区 基因Ⅱ与基因Ⅳ
基因Ⅷ与基因Ⅲ
重组操作 双链DNA
单链DNA 可用于DNA序列分析和位点特异性突变的研究
M13mp18和M13mp19载体的限制酶切图
• 主要不足之处： 易产生外源DNA片段的部分缺失，且外源DNA 越大其缺失频率越高，一般情况下其有效的最 大克隆能力仅1500bp
Λgt11载体的限制性酶切位点
利用特异性抗体作为探针筛选Λgt11表达文库
• 插入位点位于LacZ基因的C末端，可作为β-半 乳糖苷酶融合蛋白表达； 可用抗体探针筛选
• 蓝白斑筛选
• 温度敏感诱导表达
• 裂解基因中的琥珀突变
• UAG UAA UGA
琥珀型 赭石型 乳白型
amber ochre opal
• 无义突变（nonsense） 使蛋白质长度提前终止，引起多肽长度变化
• 抑制基因 编码生成突变的tRNA（反密码子突变或其它位置突 变），识别无义密码子，但携带氨基酸。
• 某些载体的宿主菌带有一个或者两个很强的琥 珀突变抑制基因 SupE 在UAG密码子的位置上加上谷氨酰胺 SupF 在UAG密码子的位置上加上酪氨酸
• lacZ’内，具有一段多克隆位点序列（MCS） 在正常情况下，插入到MCS的外源DNA片段， 都会阻断α-肽链的合成，因此含有重组质粒载 体的克隆是无色的，它可以与含有非重组质粒 载体的克隆形成的蓝色“背景”明显地区别开 来
3、比较pGEM和pUC18/19
• 含有噬菌体的启动子，可合成RNA • 用途：
• 在病毒颗粒内线性，两端单链互补被称作 cos末端(cos end)
• 一旦进入细胞，两个cos末端就会迅速相互结合， 形成有缺口的环状基因组，细胞的DNA连接酶 可以修补该缺口
• 溶源 寄主细胞仍然存活着并持续地进行细胞分裂， 不产生子代噬菌体颗粒
• 溶菌 寄主细胞因裂解而致死，释放出许多噬菌体颗 粒
λDNA限制图谱
2、Charon系列载体 构建基因组文库
Charon28的限制性酶切位点（5-24Kb）
3、EMBL系列载体 构建基因组文库
MboⅠ、BamHⅠ、BglⅡ、BclⅠ、XhoⅠ、SalⅠ、EcoRⅠ
EMBL3和EMBL4的限制性酶切位点（23Kb）
4、λgt系列载体 构建cDNA文库（6-8.2Kb)） 表达
带pMBI（或ColE1）复制起点的质粒在复制起始阶段所 产生的转录物的方向及其粗略大小
质粒不亲和现象图解
2、比较pBR322和pUC18/19
pBR322质粒限制性内切酶图谱
pUC18/19质粒的限制性内切酶图谱
pUC18/19质粒的多克隆位点
• 多克隆位点 • 筛选标记 α互补 • 拷贝数 • 分子量
第一节 质粒载体 第二节 λ噬菌体载体 第三节 粘质粒载体 第四节 M13噬菌体载体及噬菌粒 第五节 真核细胞用载体 第六节 人工染色体
第一节 质粒载体
1、一般特性 • 双链闭合环状 • 松弛型质粒/严紧型质粒
氯霉素、壮观霉素
• ColE1复制起点质粒的复制调控 • 质粒的不相容性
利用同一复制系统的不同质粒不能稳定共存的现象